Среди всех этих переделок особое место занимает тюнинг подвески ВАЗ — она является одним из определяющих факторов управляемости, ходовых качеств и безопасности на дороге.

Чтобы усовершенствовать подвеску, вы можете обратиться за помощью к специалистам автосервиса или сделать всю работу своими руками. Это поможет вам сократить финансовые расходы и сделать всё так, как вы считаете нужным. Давайте рассмотрим некоторые возможности усовершенствования в различных моделях автомобилей марки ВАЗ.

Тюнинг подвески в моделях ВАЗ 2101—2107

Недостаток передней и задней подвески ВАЗ 2107 и в автомобилях этой группы в том, что она слишком мягкая. Это создаёт определённые неудобства, особенно при полной загрузке. Колёса цепляют арки, что существенно затрудняет движение.

Хорошим выходом из положения является установка на передней подвеске пружин от автомобиля «Нива 2121» — они хорошо подходят по размеру. Они придадут необходимую жёсткость, и авто при полной загрузке перестанет проседать. Такие пружины могут подойти не только для передней, но и для задней подвески. Кроме того, надо будет заменить резиновые отбойники.

Далее будет необходимо заменить амортизаторы, что также может улучшить ходовые качества авто. Лучше всего выбрать газомаслянные — неподвижность штока придаст больше упругости передней части машины.

Однако следует учесть, что после замены пружин и амортизаторов есть высокая вероятность того, что увеличится крен вашего авто на поворотах. Чтобы его минимизировать, установите стабилизаторы поперечной устойчивости повышенной жёсткости — они хорошо решают подобные проблемы.

Ещё одним средством улучшения своими руками ситуации являются треугольные рычаги. Они используются для более точной настройки. Рычаги дают возможность установки отрицательного развала. При этом вам не потребуется замена нижних болтов, которые осуществляют крепление к балке.

Кроме того, устанавливая треугольные рычаги, вы получаете возможность увеличить кастор – угол продольного наклона оси поворота колеса. Это помогает ощутимо улучшить управляемость вашей машины.Однако, устанавливая рычаги, вы должны будете отрегулировать развал-схождение. Кроме того, вам понадобятся косточки стабилизатора ВАЗ 2110.

Чтобы придать вашей машине большей устойчивости, вы можете обеспечить ей более низкую посадку. Для этого используется задняя поперечная тяга — она позволит вам выполнить регулировку моста относительно кузова.

Тюнинг подвески ВАЗ 2108—2109

У «восьмёрки» и «девятки», по сути, те же методы улучшения, что и в предыдущем разделе. Можно порекомендовать внести своими руками следующие изменения:

• установить стабилизатор поперечной устойчивости от ВАЗ 2110 — он поможет снизить крен на поворотах;
• спереди поставить газовые амортизаторы Plaza;
• сделать минусовой развал колёс;
• увеличить угол продольного наклона колёс спереди авто.

Это поможет улучшить ходовые качества и управляемость вашего авто.

Тюнинг автомобилей ВАЗ 2110—2112

Эту группу машин можно совершенствовать по той же схеме, которая описана выше. Или же пойти другим путём — установить своими руками более функциональную подвеску, например, от «Приоры».

Такая подвеска гораздо жёстче, руль лучше слушается водителя, ощущается собранность и чёткость. Особенно хорошо все преимущества заметны при прохождении ямок и впадин при движении автомобиля. Передок при этом становится выше на пару сантиметров.

Некоторые, правда, наоборот ставят подвеску от ВАЗ 2110 на «Приору»: для разных автолюбителей — разные предпочтения. Невозможно придумать какое-нибудь утверждение, с которым все согласятся на 100%.

Тюнинг автомобилей ВАЗ 2113—2115

Переднеприводные машины ВАЗ 2113, 2114 и 2115 принято снабжать спортивной подвеской. Она улучшает устойчивость и управляемость во время движения:

• для начала передние стойки дорабатываем, превращая их из маслонаполненных в газомаслянные. Это делается путём закачивания газа в рабочую камеру. Благодаря этому шток после погружения самостоятельно примет первоначальное положение;
• чтобы уберечь себя от вылета пружины во время движения, выполняем ограничение хода штока;
• штатные штоки можно заменить на «кайловеры» — спортивные стойки. Они дадут возможность ниже посадить автомобиль. Это придаст ему устойчивости. При этом используются укороченные пружины, что помогает минимизировать уровень крена машины на поворотах;
• вышеописанные треугольные рычаги. Обеспечат улучшение управляемости автомобиля, точность настройки подвески и увеличение кастора.

Так мы тюнингуем своими руками подвеску у моделей группы 2113—2115, делая её спортивной. При этом улучшается управляемость, уменьшается крен, и повышается ваша безопасность на дороге во время движения автомобиля.

Заключение

Многие знатоки уверяют, что тюнинг подвески автомобилей марки ВАЗ неизбежен, если вы хотите, чтобы машина хорошо вас слушалась. Для этого вам придётся внести в конструкцию ряд изменений. Они сделают посадку более низкой и устойчивой, руль — послушным, придадут машине упругости и собранности.

[democracy]

[democracy]

Автор: Екатерина

Лучшие колки для вашей гитары? ПОЛНОЕ РУКОВОДСТВО!

Способность оставаться в гармонии — одна из самых отличительных черт, отличающих профессиональных гитаристов…

Если вы ищете вместо ваших колков, то вам нужен , чтобы найти лучшую замену. Это потому, что колышки играют решающую роль в том, чтобы ваша гитара оставалась настроенной!

Поднимите свои колки на новый уровень!

Какие колки для настройки гитары самые лучшие? Лучшие тюнинг-колышки включают в себя:

1. Grover 502C 6 Линейные рутины Roto-Grip Tainers
2. Gotoh 3 A-Side Lockin Tuners
3. Waverly’s 3 A-Soke старинные акустические
4. Golden Gate Classical Acoustic
5. Schaller Vintage Closed-back

Как правило, лучшими колками для гитары являются герметичные колки с механическим замком .Это связано с тем, что они держат шестерни в защитном кожухе (что продлевает срок их службы) и не допускают проскальзывания струны. Однако, если вы платите за винтажные тюнеры премиум-класса (например, от Waverly), то они будут работать так же хорошо. Но стоят намного дороже…

Выше вы видите пять моих лучших колков для настройки гитары. В этой статье мы обсудим их более подробно… и определим, какой вариант подходит именно вам!

1.

Мне нравится гитарный тюнер 505C6, потому что он прочный, высококачественный и обеспечивает очень точную настройку.Мало того, они поставляются со встроенной системой блокировки, которая предотвращает проскальзывание струн, что позволит вашей гитаре дольше сохранять свою настройку!

• 6 in line, набор из 6 штук
• Уменьшенная версия шкафчиков Roto-Grip стандартного размера для линейных и меньших головок грифа
• Для тех, кто предпочитает ощущение легкости
• Страна производства — Тайвань , провинция Китая

Эта модель совместима с 6-рядными гитарами (например, с крылом).

Компания Grover хорошо известна производством колков, и за многие годы их неоспоримое качество принесло им такую ​​репутацию. На самом деле, если вы покупаете гитару премиум-класса, есть большая вероятность, что на ней уже есть набор груров.

Еще один высококачественный набор колков. Опять же, они предлагают очень плавную и точную систему передач, поэтому ваша гитара может быть настроена очень точно, и имеют возможность блокировки для предотвращения проскальзывания струны.

• Традиционная функция блокировки с помощью винта с накатанной головкой с технологией Gotoh
• Колки с замком отлично подходят для тремоло-гитар без блокировки и для музыкантов, которые сильно гнут струны
• Стойки для струн Rock-Solid устраняют ослабление, улучшая стабильность настройки, а две высоты стойки устраняют необходимость в растяжках для струн
• Передаточное число 18:1 для точной настройки
• Включает 6 колков (3 слева, 3 справа) и монтажное оборудование ( 6 втулок, шайб и винтов)

Эта модель совместима с 3 гитарами с каждой стороны (например, дизайн Les Paul).

Так же, как Grover, Gotoh очень хорошо известен производством высококачественных колков. Это то, что я использую лично, и они входят в стандартную комплектацию моей акустики Tanglewood.

3. Винтажные акустические колки Waverly’s, по 3 на каждую сторону

Колки Waverly’s — это бренд премиум-класса, колки которого изготавливаются вручную.

Они хорошо держат строй, а их передаточное число 16:1 обеспечивает очень точную настройку. Если у вас есть винтажная акустическая гитара, это повысит ее стоимость, так что это будет хорошей инвестицией.Особенно, если у вас есть легендарная гитара. Кроме того, диаметр отверстия 9,8 мм подойдет для старой гитары с винтажными колками.

4.

Golden Gate утверждают, что их тюнеры рассчитаны на всю жизнь. Они являются первым выбором для классической акустики, поскольку они отличаются долговечностью и доступной ценой.

Все наборы колков имеют 3 колки на пластине с открытой шестерней и большие пластиковые ролики для струн, необходимые при использовании нейлоновых или композитных струн. Это высочайшее качество, сочетающее в себе новый стиль, плавность и точность настройки.

• Набор из двух колков с гравировкой 3 на планке
• Точные шестерни 18:1 гарантируют точное интонирование и стабильность строя в течение многих лет
• Отделка из состаренной латуни обеспечивает функциональность и долговременную красоту
• Черные кнопки уникального дизайна прекрасно смотрятся и их легко держать
• Чтобы узнать больше, см. описание продукта ниже. :1 шестерни гарантируют точное интонирование и стабильность строя на долгие годы.Они также имеют красивую эстетику с красиво выгравированными декоративными пластинами с отделкой из состаренной латуни.

  5. Винтажные закрытые колки Schaller

  Schaller — немецкий производитель оборудования для музыкальных инструментов.

  Машинные головки Schaller — оригинальная серия G Deluxe Keystone DR Toplocking Nickel
  • Original SeriesST6K Верхнее крепление головки машины с блокировкой. Соотношение 1:16Диаметр 9,8 ммС болтом типа «банджо» в качестве контрфорса Пуговица-тюльпан (пластик)Вес 30 г/шт.
  • Машинная полировка Сменная головка машины с 2 винтами и полым болтом в качестве опоры.
  • Блестящая зеленая кнопка трапецеидального искажения.
  • 3 на сторону, поверхность никель.
  • 6 резьбовых втулок, 6 ступенчатых шайб, 12 крепежных винтов.

  Оригинальная серияST6K Фиксирующая машинная головка Верхнее крепление с передаточным отношением 1:16 для превосходной точности настройки. Кроме того, диаметр отверстия 9,8 мм подойдет для старой гитары с винтажными колками.

  Проблемы с колками для настройки

  Если у вашей гитары проблемы с колками для настройки, ваша гитара может иметь плохую интонацию и резонанс, а также гудение ладов.

  Колки для настройки — очень сложные устройства.

  На самом деле очень удивительно узнать, насколько сложны колки на самом деле!

  Они состоят из зубчатой ​​​​системы, способной изменять частоту струн при сильном натяжении. Есть множество крошечных компонентов, которые обеспечивают работу сложного устройства.

  Однако это также означает, что есть много потенциальных проблем, которые могут пойти не так. Из-за такого сложного устройства вы не сможете их починить, а если у вас возникли проблемы с настройкой, то пора вообще начинать искать колки на замену.

  Это совершенно нормально; замена колков — популярная модификация, которую вам нужно сделать, если ваша гитара уже давно (более двух лет). Это связано с тем, что ваша гитара постоянно находится под напряжением, и в конечном итоге ваши колки для настройки гитары (среди прочего) будут растягиваться, в конечном итоге треснут и сломаются.

  К счастью, у этого есть и положительная сторона. Производители проектируют гитарные колки таким образом, чтобы их можно было легко заменить и модернизировать, когда придет время.

  Когда менять колки для настройки

  Если у вас возникли проблемы с настройкой, и головка машины является основной причиной, то вы, вероятно, столкнулись с одной из распространенных проблем:

  • Колебание стоек машины — относится к штифту, который закрепляет струну на бабке. Для струн, чтобы найти желаемую настройку, требуется сильное натяжение струн. Головки машин могут выдерживать напряжение только до тех пор, пока не начнут ломаться.
  • Люфт выравнивания шестерни – люфт представляет собой величину свободного хода, ощущаемую при повороте кнопки из одного направления в другое. Поворот кнопки приводит к повороту стойки (той части, через которую проходит струна), и если при повороте кнопки происходит слишком большое движение, определение точной высоты звука может быть затруднено.Люфт центровки шестерен возникает, когда зубья на шестернях со временем изнашиваются.
  • Разрывы пуговицы – пуговицы являются частью захвата штифта машины. Здесь вы берете головку машины и поворачиваете, чтобы изменить высоту тона. Также часто можно увидеть поломку пуговицы (особенно с пластиковыми пуговицами).

  Если у вас нет этих проблем, вы можете пересмотреть возможную основную причину. Другие возможные причины, которые следует учитывать, связаны либо с напряжением, либо с контактом. Везде, где есть контакт (между струной и другим компонентом), например, порожек, головка машины, бридж, лады и механизм. Если у вас проблемы с интонацией, то обычно это проблема с натяжением, которое может включать в себя машинные колки, трастовый стержень или даже в некоторых случаях шейные суставы.

  Типы колков

  Уверен, вы знаете, что существует множество типов колков. Все различные типы делятся на две категории: либо герметичные машины, либо винтажные тюнеры.

  Типы тюнинговых колышек включают в себя:

  • Герметичный аппарат
    • Блокируемые машины
    • Машина блокировки
    • старинные машины на открытом воздухе
    • старинные замкнутые машины
    • бокового монтируемого машины PEGS

    Если вы заинтересованы Чтобы узнать обо всех типах колков, пожалуйста, посетите пост, который я написал обо всех типах колков.

    Марки колков для колков

    Первые типы колков с открытыми колками, которые можно было найти на любой классической акустике.

    • Только в 60-х годах стал популярным стиль Grover с закрытой спиной.
    • В 70-х колки Schaller вышли на сцену и стали следующей лучшей покупкой.
    • Затем на сцену вышел Gotoh, производивший как закрытые, так и открытые колки…
    • Сегодня, если вам нужен действительно премиальный набор колков, вы обратите внимание на Waverly’s.

    Но есть также много популярных сегодня тюнеров других производителей. Обычно их можно заметить по простоте и отсутствию фирменной гравировки на металлической поверхности.Машинные головки без маркировки обычно плохо работают.

    Выбор правильной замены!

    Выбор правильной замены прост, но требует некоторого размышления.

    Сменные колки для настройки гитары бывают разных вариаций, но каждый тип колков имеет свое предназначение. Это означает, что вы должны четко понимать, каковы ваши цели.

    Например, ваша гитара является предметом коллекционирования… Или вы хотите улучшить ее функциональность?

    Как правило, есть три цели:

    • Коллекционность — это когда вы хотите восстановить винтажную гитару до ее первоначального состояния
    • Внешний вид — это когда вы хотите, чтобы новые колки гармонировали с оригинальной гитарой
    • Функциональность – это выбор наилучших функциональных прищепок. Однако при установке могут быть внесены некоторые модификации, которые могут обесценить гитару.

    В целом, решение о том, какие колки являются лучшей заменой, требует удивительно тщательного обдумывания в зависимости от ваших целей.

    Какие колки лучше всего подходят для замены по внешнему виду  

    При смене колков рекомендуется приобрести набор колков той же формы, что и исходный набор (это не обязательно тот же бренд или типа).

    На самом деле, если вы делаете апгрейд и для вас важен внешний вид, то на рынке есть несколько машин хорошего качества, но при этом недорогих.

    Сюда могут входить такие бренды, как:

    • Grover . У меня на моем Tanglewood установлено несколько герметичных машин Grover, и они очень плавные, а также настроены на очень точную подачу.
    • Kluson — Kluson очень популярны среди гитар в винтажном стиле, если вы ищете винтажный колок закрытого типа.
    • Schaller – Schaller является лидером рынка и производит немецкое качество.

    Тем не менее, поиск головки машины той же формы, что и ваша старая, является вашим приоритетом.

    Это связано с тем, что обесцвечиваются оттенки дерева при установке новых машин другого размера. Что вы заметите, так это линии/рощицы в лесу, где сидели старые настройщики. Кроме того, у вас также будут проблемы с расположением отверстий для винтов , которые прикрепляют штифты станка к передней бабке.

    Давайте рассмотрим их подробнее ниже…

    Обесцвечивание оттенков дерева

    Если вы заменяете гитарные колки в первый раз, вы заметите некоторое обесцвечивание между лаками в оттенках дерева. Это обесцвечивание между древесиной под размещением старой головки машины становится видимым, как только вы снимаете головку машины.

    Это связано с тем, что когда вы подвергаете свою гитару воздействию естественного света, древесина гитары становится более светлой.

    Если вы настроены на совершенно другую форму настроечного устройства, оно может не очень хорошо покрывать выцветшую область. Если эти канавки все еще видны, после установки новых станков вы можете подумать о том, чтобы отшлифовать заднюю часть передней бабки, а в некоторых случаях вы можете закрасить ее, чтобы сделать цвет более ровным.

    Если вас не смущает внешний вид, вы всегда можете оставить их как есть.

    Заполнение отверстий для винтов

    Когда вы переходите на головку машины другого размера, размещение отверстий для винтов также является еще одной проблемой, с которой вы столкнетесь.Чтобы обойти эту проблему, вам нужно будет просверлить новые отверстия в передней бабке.

    В целом, замена колков винтажной гитары на колки другого дизайна может не соответствовать первоначальному «звучанию» гитары.

    В целом, лучшей заменой фактора внешнего вида является поиск колышков машины такой же формы, как у текущей машины.

    Лучшие заменители для коллекционирования

    Если у вас есть винтажная гитара, которая является предметом коллекционирования, или вы только что купили винтажную гитару, будьте осторожны при замене колков.

    Лучшей заменой будут колки для машин в винтажном стиле, и у вас есть два варианта: винтажные с открытой спиной и винтажные с закрытой спинкой.

    Я бы посоветовал вам присмотреться к колкам Gotoh , так как они отлично подойдут для винтажной гитары. Кроме того, для действительно высокого класса вы можете найти тюнеры Waverly (которые в 3 раза дороже). Для гитары, которая является коллекционной и стоит больших денег, я бы сразу же заменил колки на какие-нибудь открытые колки Waverly Vintage.

    Да, это очень дорого. Но они изготавливаются вручную и имеют самое высокое качество на рынке.

    Открытая спина Vs. Closed-Back

    Если у вас есть винтажная гитара, вы можете выбирать между винтажной открытой или винтажной закрытой декой, тогда я всегда рекомендую открытую деку только потому, что у них такая красивая эстетика.

    Почему не герметичные автоматы на винтажной гитаре?

    Я бы никогда не обновил винтажную гитару до запечатанной машины, потому что этот тип модернизации потребует некоторых модификаций гитары. Это может включать в себя сверление передней бабки или изменение формы отверстия для соответствия новым машинам.

    Сверление новых отверстий в древесине вашей гитары — это то, чего вам определенно следует избегать, поскольку модификация необратима.

    Это может быть непростой задачей, и вам может потребоваться отшлифовать переднюю бабку, чтобы все совпадало. Однако шлифовка головы грифа может обесценить вашу гитару, так как она не выглядит привлекательно.

    Замена герметичных колков на традиционные колки

    Обычно вы покупаете старинную гитару, а кто-то уже заменил винтажные колки на герметичные колки.

    Если это так, то вы можете подумать о том, чтобы заменить их на исходные колки и попытаться восстановить часть утерянного значения.

    Проблема, с которой вы сталкиваетесь, когда хотите вернуть винтажную гитару в исходное состояние, заключается в том, что скважина будет увеличена, и старые винтажные инструменты больше не будут плотно прилегать к ней, как раньше.

    Это связано с тем, что винтажные колки с открытой шестерней имеют диаметр около 11/32″ (8,75 мм). В то время как герметичные тюнеры больше 13/32″ (10.0 мм) в диаметре.

    Если существующее отверстие уже было увеличено, необходимо приобрести набор переходных втулок. Это сделано для того, чтобы головка машины плотно прилегала, как когда-то.

    Наилучшие заменители по функциональности

    Наилучшим типом гитарных колков с точки зрения функциональности являются герметичные машины.

    Благодаря достижениям в области технологий герметичные колки, без сомнения, являются лучшими колками.

    Если у вас есть старая гитара и вы хотите обновить винтажные колки, увеличение существующих отверстий для новых колков неизбежно.

    Лично мне больше всего нравится Grover’s, но Schaller’s также хороший выбор для закрытых машин.

    Увеличение отверстия

    При замене винтажных колков на герметичные вы обязательно столкнетесь с тем, что герметичные механизмы не проходят через отверстие в винтажных колках, в связи с чем вам придется увеличить отверстия и просверлить новые места для установки отверстия под шурупы.

    Преобразование традиционных тюнеров в герметичные механизмы

    Для установки герметичных механизмов отверстие просверливается насквозь без уступа, чтобы приспособиться к большему корпусу герметичных зубчатых передач.

    Это означает, что если вы устанавливаете этот тип закладной гайки на винтажную гитару, вам нужно будет увеличить отверстия для колков (инструментом для этой работы является коническая развертка).

    Еще один момент, на который следует обратить внимание, это положение выступа монтажного винта. Положение крепежного винта всегда разное.

    Таким образом, при переходе с винтажной на запечатанную гитару ожидайте сверления новых отверстий для винта, что может повлиять на стоимость гитары.

    Вам также придется решить, что делать со старыми отверстиями под винты, вы можете оставить их или заполнить.Было бы лучше заполнить их, чтобы мусор и грязь не попали туда и не испортили древесину, что обычно происходит в течение нескольких лет после их замены.

    Заключение

    Каковы лучшие «типы» колков?

    Для этого нам нужно понять тип машинного колышка и марку. Тогда лучше всего понять свои цели. Есть три типа целей при замене колков, в том числе внешний вид, возможность коллекционирования и функциональность.

    Если вы хотите заменить колышек для настройки, то лучше всего заменить его точно таким же устройством. Однако бывают обстоятельства, когда это может быть не лучшим вариантом в зависимости от типа вашей гитары.

    Например, если вы приобрели классическую гитару и хотите улучшить ее функциональность, вам следует рассмотреть вариант с запечатанной машиной. Тем не менее, если вы хотите сделать апгрейд для коллекционирования, вам стоит обратить внимание на открытую деку в винтажном стиле, так как это увеличивает ценность вашей гитары.

    Кроме того, некоторым людям нравится контролировать изменение высоты тона во время игры. Таким образом, некоторые люди любят использовать ударную планку. Однако проскальзывание строки является распространенной проблемой, которая может возникнуть из-за таких эффектов. Таким образом, блокирующие тюнеры могут помочь решить эту проблему.

    Машины с герметичными шестернями, безусловно, лучшие машины для настройки. Однако, если вы играете на старинной гитаре, скорее всего, у них также есть винтажные головки.

    Однако может наступить момент, когда вы купите коллекционную дополнительную гитару.Стоимость гитары будет выше с традиционными винтажными колками с открытой спиной. Если ваша гитара является предметом коллекционирования, я бы посоветовал заменить винтажную машину, так как она потеряет ценность гитары.

    Настройка гитары методом 5-го лада

    Метод настройки 5-го лада — это простой способ проверить настройку и настроить гитару. С помощью этого метода вы должны настроить по крайней мере одну из ваших струн (предпочтительно нижнюю струну E), потому что от этой струны вы будете настраивать остальные свои струны, используя ее в качестве эталона. Если у вас нет доступа к камертону, клавиатуре или другому настраивающему устройству, ничего страшного. Вы можете подобрать одну струну как можно ближе на слух, а затем настроить на нее остальную часть гитары. Гитара будет настроена сама на себя и будет звучать просто отлично, даже если каждая струна будет немного резкой или плоской.

    Открытые струны — Ниже я расскажу об игре на открытых струнах. Играть на открытой струне означает играть на струне, ничего не раздражая. Вот почему он называется Open.

    Как настроить гитару

    Используйте картинку в качестве справки, если предположить, что ваша 6-я струна (нижняя струна ми) настроена….

    • Зажмите 5-й лад на 6-й струне. Если ваша гитара настроена или близка, то, если вы затронете ладовую 6-ю струну и открытую 5-ю струну, они должны звучать довольно близко. Настраивайте колки на 5-й струне, пока они не совпадут с 6-й струной.

    • Теперь, когда 5-я струна настроена, мы можем настроить на нее 4-ю струну. Это тот же процесс, что и раньше, зажмите 5-й лад на 5-й струне и сыграйте струну и открытую 4-ю струну, а затем поверните колышки на 4-й струне, пока они не совпадут.

    • Повторите тот же процесс, зажмите 5-й лад на 4-й струне и настройте открытую 3-ю струну на ладовую 4-ю струну.

    • Вот где это меняется. Вместо 5-го лада на 3-й струне, , вы нажимаете на 4-й лад (как показано на картинке). Таким образом, вы нажимаете на 4-й лад на 3-й струне и настраиваете на него открытую 2-ю струну.

    • Для последней струны на этот раз мы нажимаем на 5-й лад на 2-й струне. Затем мы настраиваем Open 1st String на 5-й лад 2nd String.

    Знаете ли вы, почему мы назвали этот метод «методом 5-го лада»? Теперь ваша гитара должна быть настроена. Для простой проверки, правильно ли вы это делаете, вы одновременно играете на 1-й и 6-й струнах. Они должны звучать одинаково, но в разных октавах. Они оба настроены на ми, просто в разных октавах.

    Табулатура для гитары для проверки настройки

    Эта вкладка показывает, на каких ладах и струнах играть, чтобы проверить настройку.

    e:—————0—0-:
    B:————0—5—-:
    G:— ——0—4——-:
    Д:——0—5———-:
    А:—0—5 ————-:
    E:—5—————0-:
    

    Видео как это сделать

    Поздравляем с настройкой гитары!

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

    ---

    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    ---

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

    ---

    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Как правильно настроить гитару

    Перед каждым начинающим музыкантом встает вопрос: «Как настроить акустическую гитару?» Для начала нужно определиться, во что вы будете играть? Это могут быть пальцы, медиатор, слайд. Производить настройку нужно тем же инструментом, на котором вы будете играть, так как каждый из них с разной силой воздействует на струны.

    От того, насколько правильно настроена гитара, зависит качество звучания сыгранной музыкантом мелодии. Поэтому каждый, даже начинающий музыкант, должен уметь настраивать свой инструмент. О том, как правильно настроить гитару, мы расскажем ниже.

    В первую очередь нужно уметь настраивать на слух. Благодаря этому методу вы можете настроить за 5-10 минут, даже если вы просто дергали за ниточки.

    Наиболее популярным среди начинающих является классический метод. Это довольно просто и интуитивно понятно. Для правильного звучания достаточно тонко настроить одну струну — первую, используя любой подручный механизм. Для того, чтобы понять, как правильно настроить гитару, нужно знать стандартное устройство инструмента.

    90 477

    Примечание

    Строка

    Значение

    Е

    1

    второй октавы

    B

    2

    Первая октава

    0480

    соль Octave первые

    D

    4

    80

    Первая октава

    5

    для Octave Mell

    6

    6

    9 octave Big

    для настройки первой строки, вы можно использовать уже настроенный инструмент, например, пианино. За эталон берется нота первой октавы (ми). Также подойдет:

    • программа на смартфон или ПК;
    камертон
    • — самый точный способ;
    • тон набора соответствует ноте Е.

    Необходимо, чтобы струна звучала в унисон со стандартом. Остальное настроить не сложно. Последовательность такая:

    — Вторая строка корректируется, опираясь на первую. Его зажимают на пятом ладу и подгоняют так, чтобы он совпадал со звуком первой открытой струны.

    — 3-я — зажимается на четвертом ладу и регулируется до совпадения с открытой второй струной.

    — 4-й — зажат на пятом ладу, звук должен соответствовать третьему свободному.

    — 5-я — зажата на пятом ладу, подогнана под совпадение с четвертой открытой.

    — 6-й (самый толстый, верхний), давит на пятый лад и подгоняется до совпадения с пятым открытым. Звучит как первый с разницей в две октавы.

    После того, как настройка гитары закончена, лучше всего еще раз пройтись по струнам для регулировки, так как при натяжении одной из них другая может ослабнуть. Если все сделано правильно, ваш инструмент будет настроен практически идеально.

    Как правильно настроить гитару.

    Это более точный и правильный способ настройки, так как иногда недостаточно просто настроить прибор в режиме. Мигалкой называется прием касания пальцем струны левой руки посередине лада и извлечение звука правой рукой с одновременным снятием пальца со струны.

    Последовательность:

    — 1-я струна настраивается так же, как и в классическом методе с помощью другого инструмента;

    — 6-я струна — с помощью флажка на пятом ладу настраивается на совпадение с открытым первым;

    — 5-я струна — настраивается с помощью флажка на седьмом ладу и по звучанию должна соответствовать первому открытому;

    — 4-я струна — с помощью флажолета на седьмом ладу, по звучанию должна совпадать с флажолом на пятом ладу пятой струны;

    — 3-я струна — с помощью флажка на седьмом ладу соответствует флажку четвертой струны на пятом ладу;

    — 2-я струна — с помощью флажолета на пятом ладу настраивается на совпадение с флажолетом первой струны, взятой на седьмом ладу.

    Вот несколько способов правильно настроить гитару. Также можно использовать современные методы, такие как настройка онлайн или с помощью тюнера. Однако знание того, как настроить инструмент на слух, всегда будет с вами и поможет, когда под рукой нет ничего, кроме гитары.

    (PDF) Прецизионность и достоверность измерений FRET для отдельных молекул — многолабораторное сравнительное исследование

    5. Ha, T. et al. Исследование взаимодействия между двумя одиночными молекулами:

    резонансный перенос энергии флуоресценции между одним донором и одним

    акцептором.проц. Натл акад. науч. США 93, 6264–6268 (1996).

    6. Schuler, B., Lipman, E.A., Steinbach, P.J., Kumke, M. & Eaton, W.A.

    Полипролин и «спектроскопическая линейка», пересмотренные с помощью флуоресценции одиночной молекулы

    . проц. Натл акад. науч. США 102, 2754–2759 (2005).

    7. Choi, U.B. et al. Одномолекулярная модель комплекса слияния синаптотагмина

    1-SNARE, полученная из FRET. Нац. Структура Мол. биол. 17, 318–384 (2010).

    8. Калинин С.и другие. Инструментарий и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничением FRET

    . Нац. Методы 9, 1218–1227 (2012).

    9. Hellenkamp, ​​B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M. & Hugel, T.

    Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемые самосогласованными

    FRET Networks. Нац. Методы 14, 174–180 (2017).

    10. Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F. & Michaelis, J. Fast-NPS — цепь Маркова .вычисл. физ. коммун. 219, 377–389 (2017).

    11. Хофманн, Д., Корцдорфер, Т. и Куммель, С. Перенос энергии и приближение дипольной связи Форстера

    исследованы в схеме Кон-Шама

    в реальном времени. физ. Ред. А 82, 012509 (2010).

    12. Spiegel, JD, Fulle, S., Kleinschmidt, M., Gohlke, H. & Marian, CM Отказ

    IDA в системах FRET на близких расстояниях между красителями смягчается

    частыми низкими значениями k2 . Дж.физ. хим. Б. 120, 8845–8862 (2016).

    13. Sakon, J.J. & Weninger, K.R. Определение конформации отдельных

    белков в живых клетках. Нац. Методы 7, 203–205 (2010).

    14. Сабанаягам, Ч.Р., Эйд, Дж.С. и Меллер, А. Использование передачи энергии флуоресцентного резонанса

    для измерения расстояний вдоль отдельных молекул ДНК:

    поправки из-за неидеального переноса. Дж. Хим. физ. 122, 61103–61107 (2005).

    15. Макканн, Дж. Дж., Choi, U.B., Zheng, L., Weninger, K. & Bowen, M.E.

    Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET из иммобилизованных

    одиночных молекул. Биофиз. Журнал 99, 961–970 (2010).

    16. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J. & Seidel, C. A. M.

    Точные исследования одной молекулы FRET с использованием многопараметрического флуоресцентного детектирования

    . Методы Энзимол. 475, 455–514 (2010).

    17. Lee, N.K. et al. Точные измерения FRET в пределах одной диффузии

    биомолекул с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз. J. 88, 2939–2953 (2005).

    18. Кудрявцев В. и соавт. Комбинация MFD и PIE для точных однопарных измерений резонансной передачи энергии Förster

    . ChemPhysChem 13, 1060–1078 (2012).

    19. Hohlbein, J., Craggs, T.D. & Cordes, T. Возбуждение лазером переменного тока:

    одномолекулярный FRET и другие. хим. соц. 43, 1156–1171 (2014).

    20. Margeat, E. et al. Прямое наблюдение за абортивной инициацией и ускользанием промотора

    в одиночных иммобилизованных транскрипционных комплексах.Биофиз. J. 90,

    1419–1431 (2006).

    21. Мущелок А. и соавт. Система нанопозиционирования для структурного анализа макромолекул

    . Нац. Методы 5, 965–971 (2008).

    22. Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J. & Michaelis, J. Количественная структурная

    информация по одномолекулярному FRET. Фарадей Обсудить. 184, 117–129 (2015).

    23. Dimura, M. et al. Количественные исследования FRET и интегративное моделирование раскрывают

    структуру и динамику биомолекулярных систем. Курс. мнение Структура биол.

    40, 163–185 (2016).

    24. Brunger, A.T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S. & Weninger, K.R. Трехмерное молекулярное моделирование с FRET одной молекулы. Дж. Структура. биол.

    173, 497–505 (2011).

    25. Craggs, T.D. et al. Конформационная динамика субстрата управляет структурно-специфическим

    распознаванием ДНК с гэпом ДНК-полимеразой. Препринт bioRxiv на https://

    www.biorxiv.org/content/early/2018/02/10/263038 (2018).

    26. Надь, Дж., Эйлерт, Т. и Михаэлис, Дж. Точность и достоверность структурных исследований на основе smFRET

    — эталонное исследование системы FAST-Nano-Positioning.

    J. Chem. физ. 148, 123308 (2018).

    27. Ивани И. и др. Parmbsc1: улучшенное силовое поле для моделирования ДНК.

    Нац. Методы 13, 55–58 (2016).

    28. Neubauer, H. et al. Ориентационная и динамическая гетерогенность родамина

    6G, терминально присоединенного к спирали ДНК, обнаружена методами ЯМР и одиночной молекулярной

    флуоресцентной спектроскопии. Варенье. хим. соц. 129, 12746–12755 (2007).

    29. Iqbal, A. et al. Ориентационная зависимость флуоресцентного переноса энергии между

    Cy3 и Cy5, присоединенными на конце к двухцепочечным нуклеиновым кислотам. проц.

    Нац. акад. науч. США 105, 11176–11181 (2008 г.).

    30. Peulen, T. O., Opanasyuk, O. & Seidel, C. A. M. Сочетание графических и

    аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа

    FRET-измерений меченых макромолекул с временным разрешением.Дж. Физ. хим. В

    121, 8211–8241 (2017).

    31. Дигман, М. А., Кайолфа, В. Р., Замаи, М. и Граттон, Э. Фазорный подход

    к анализу изображений времени жизни флуоресценции. Биофиз. Дж. 84, Л14–Л16 (2008).

    32. Капанидис А.Н. и соавт. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий

    путем возбуждения одиночных молекул переменным лазером.

    Проц. Натл акад. науч. США 101, 8936–8941 (2004).

    33.Мюллер Б. К., Зайчиков Э., Бройхле К. и Лэмб Д.К. Импульсное чередующееся возбуждение

    . Биофиз. J. 89, 3508–3522 (2005).

    34. Возняк А. К., Шредер Г. Ф., Грубмюллер Х., Зайдель С. А. М. и

    Остерхельт Ф. Одномолекулярный FRET измеряет изгибы и перегибы в ДНК.

    Проц. Натл акад. науч. США 105, 18337–18342 (2008 г.).

    35. Стельцл, Л. С., Эрленбах, Н., Хайнц, М., Приснер, Т. Ф. и Хаммер, Г. Разрешение

    конформационной динамики ДНК с разрешением Ангстрема с помощью импульсного

    электрон-электронного двойного резонанса и молекулярной динамики.Варенье. хим.

    Соц. 139, 11674–11677 (2017).

    36. Левитус М. и Ранджит С. Цианиновые красители в биофизических исследованиях:

    фотофизика полиметиновых флуоресцентных красителей в биомолекулярных средах.

    Q. Rev. Biophys. 44, 123–151 (2011).

    Благодарности

    Мы благодарим лабораторию Eaton за ранние измерения, которые помогли нам разработать это исследование. Мы

    благодарим Т. Пеулена, М. Димуру и Р. Макдональда за стимулирующие дискуссии по измерениям FRET

    , анализу данных и моделированию, а также Б.Булат для измерения флуоресценции

    Квантовые выходы

    Атто 550 и 1-мид (Атто 550). Мы также благодарим компанию Atto-Tec

    за предоставление эталонного образца красителя Atto 550 для характеристики флуоресценции.

    Авторы признательны за сетевую поддержку доктору Вильгельму Генриху и Эльзе

    Heraeus Foundation и COST Action CM1306 «Понимание движения и

    механизма в молекулярных машинах». Идея всемирного эталонного исследования стандартных линеек FRET

    возникла на 512-м семинаре WE Heraeus «Кинетика одиночных молекул

    » (Бад-Хоннеф, Германия, 2012 г.) и получила дальнейшее развитие в ходе международного симпозиума

    COST «Интеграция спектроскопических и теоретических методы анализа

    молекулярных машин» (Замок Рингберг, Германия, 2014).

    Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC; соглашение о предоставлении гранта

    №№ 261227 (для ANK), 646451 (для EL), 638536 (для TC), 671208 (для CAMS) и

    681891 (для T. Hugel)), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (предоставить MI 749/4-1

    JM, предоставить TI 329/10-1 PT и предоставить SCHL 1896/3-1 MS), Швейцарский национальный

    Научный фонд (до BS), Федеральное министерство образования и исследований Германии

    (BMBF; 03Z2EN11 до M.S.), Исследовательский фонд Фландрии (FWO; грант G0B4915N

    Дж. Хендриксу), Агентство инноваций в области науки и технологий (IWT Flanders;

    докторская стипендия NV), Датский совет по независимым исследованиям (Sapere

    Грант Aude 0602-01670B для VB), Фонд Novo Nordisk (от NNF15OC0017956 до

    VB), BBSRC Великобритании (грант BB/H01795X/1 для ANK), Национальный институт психического здоровья

    (грант MH081923 для MEB), Clemson University (начальные средства по номеру

    H.Sanabria, SRA и ISY-O.), NIH (гранты GM109832 и GM118508 до

    южнокорейских вон; грант GM112659 для T. Ha), NSF (Career Award MCS1749778 до H.

    Sanabria), Carl-Zeiss- Stiftung (докторская стипендия в EK), Stipendienstiftung

    Rheinland-Pfalz (докторская стипендия в GK), Брауншвейгская международная школа метрологии

    (B-IGSM; to BW), Исследовательская учебная группа DFG (GrK1952/1

    «Метрология сложных наносистем» на Б. W.), Университет Шеффилда (стартовый фонд

    для T.D.C.) и Национальный исследовательский фонд Кореи, финансируемый Министерством науки и ИКТ

    (NRF-2017R1A2B3010309 для NKL).

    Вклад авторов

    Б. Хелленкамп, Т. Хьюгель, Дж.М. и C.A.M.S. разработал исследование; Б. Хелленкамп, SS,

    OD, OO, RK, SRA, BA, MA, AB, HC, TE, CF, CG, GG, PH, CAH, AH,

    J. Hendrix, LLH, VH, J. Хольбейн, Б.Hua, EK, J.-YK, GK, BL, JJM, NN-R.,

    DN, TN, RQ, NCR, CR, TS, HS, LS, JT, ST, NV, AMV, BW, ISY- О.,

    и ТДЦ выполненные измерения; Б. Хелленкамп, С.С. и Т. Хьюгель сравнили

    измерений; все вышеупомянутые авторы и VB, MEB, TC, MG, EG,

    T. Ha, CGH, ANK, DCL, NKL, EAL, ML, H. Sanabria, H. Seidel, MS, BS,

    PT, KRW, JM и CS внесли свой вклад в анализ данных и прокомментировали

    рукопись; Б.Hellenkamp, ​​S.S., T.D.C., JM, C.A.M.S. и T. Hugel написали рукопись

    в консультации с O.D. и О.О.; и О.Д. выполнены расчеты

    модельных расстояний.

    Конкурирующие интересы

    Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

    Дополнительная информация

    Дополнительная информация доступна для этого документа по адресу https://doi.org/10.1038/

    s41592-018-0085-0.

    Информация о перепечатке и разрешениях доступна на сайте www.Nature.com/reprints.

    Корреспонденцию и запросы на материалы следует направлять в J.M. или C.A.M.S. или

    В.Д.С. или Т.Х.

    Примечание издателя: Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в

    опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

    Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons

    Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование,

    адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в формате

    , при условии, что вы укажете авторство первоначальный автор(ы) и источник,

    , предоставляют ссылку на лицензию Creative Commons и указывают, были ли внесены изменения.

    Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons

    статьи, если иное не указано в кредитной строке материала.

    Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а предполагаемое использование

    не разрешено законом или превышает разрешенное использование, вам потребуется

    , чтобы получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии,

    посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

    НАТУРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ | ТОМ 15 | СЕНТЯБРЬ 2018 | 669–676 | www.nature.com/naturemethods 675

    Содержание предоставлено Springer Nature, применяются условия использования. Права защищены

    Талин диссоциирует от RIAM и последовательно связывается с винкулином в ответ на действие актомиозина

    конструкции кДНК

    Все конструкции талина получены из кДНК, кодирующей человеческий талин-1, содержащей С-концевую метку His ₆ . Талин R1–R2–R3, соответствующий F2–F3–R1–R2–R3–R13, клонировали в плазмиду pETM с N-концевой меткой StrepTagII и C-концевой His ₆ .Эта конструкция была сделана в три этапа. Сначала фрагмент R2–R3 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров 1 и 2 и клонирован в сайты KpnI/BamHI pETM, что привело к промежуточной плазмиде pETM–R2–R3. R13 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров 3 и 4 и клонирован в сайты BamHI/EcoRI pETM-R2-R3, что привело к промежуточной плазмиде pETM-R2-R3-R13. Наконец, F2–F3–R1–R2–R3 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 5 и 6 и клонировали в сайты KpnI/NcoI pETM–R2–R3–R13, что привело к pETM–F2–F3–R1–R2–R3. –R13.Талин R11, соответствующий F2–F3–R11–R13, и талин R7–R8, соответствующий талину F2–F3–R7–R8–R13, клонировали в плазмиду pET-29a(+) с N-концевым StrepTagII и C -терминал Его _{6 тег} . Талин R7–R8 и R11 были синтезированы Genscript. кДНК, кодирующие талин F2–F3 (талин 196–405), талин F2–F3–R1–R2–R3 (талин 196–911) и талин R1–R8 (талин 196–1659), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием пар праймеров 7–8, 7–9, 7–10 и клонированы в сайты BamH/XhoI, BamHI/EcoRI и BamHI/EcoRI соответственно плазмиды pGEX6P1 (GE Healthcare) с N-концевой меткой GST и C- терминал Его _{6 тег} . Наши конструкции не включают субдомены F0 и F1 головы (талин 1–195), поскольку эта часть талина снижает качество экспрессии в наших руках и не участвует в связывании RIAM и винкулина. Предварительно существовавшую кДНК, кодирующую человеческий винкулин 1-851, соответствующую Vh, клонировали в сайты SalI/NotI самодельной плазмиды pGEX-6P1-EGFP. кДНК, кодирующую мышиный RIAM 1-306, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 11 и 12 и клонировали в сайты BamHI/XhoI самодельной плазмиды pGEX-6P2-mCherry с С-концевой меткой His ₆ .Праймеры, использованные для клонирования конструкций ДНК в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 1.

    Очистка белков

    Все рекомбинантные белки были экспрессированы в Escherichia coli (BL21 DE3, Invitrogen). После трансформации бактерии выращивали в 4–12 л среды LB, содержащей 0,1 мг мл ^-1 ампициллина или канамицина, при 37°С до тех пор, пока поглощение не достигало 0,8 при 600 нм. Рекомбинантные белки экспрессировали при добавлении 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактозида в течение 16 часов при 16 °C. После центрифугирования бактериальный осадок подвергали специальной стадии очистки ²² .

    Талин R1–R2–R3, R11 и R7–R8 были связаны с Ni-NTA (Ni ²⁺ -нитрилотриуксусная кислота)-агарозой (Macherey-Nalgene), промыты 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl , 20 мМ имидазол, 1 мМ β-меркаптоэтанол (BME), элюировали 50 мМ Трис, pH 7,8, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, 1 мМ BME, диализ в 20 мМ Трис, pH 7,8, 100 мМ KCl, 1, мМ замораживают в жидком азоте и хранят при температуре -80 °С.

    mCherry-RIAM 1-306, талин F2–F3, F2–F3–R1–R2–R3, R1–R8 и EGFP-Vh, содержащие N-концевую метку GST (глутатион-S-трансферазы), были связаны с глутатион-сефароза (GE Healthcare), промыта 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, и элюирована 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl и 50 мМ восстановленного L-глутатиона (Sigma-Aldrich). Для mCherry-RIAM 1-306 и EGFP-Vh GST расщепляли протеазой PreScission (GE Healthcare) в 50 мМ Tris, pH 7,8, и 500 мМ NaCl, а GST удаляли с помощью хроматографии на глутатион-сефарозе. Затем mCherry-RIAM 1-306 и талин F2–F3, F2–F3–R1–R2–R3 и R1–R8 связывали с Ni-NTA-агарозой, промывали 50 мМ Трис, pH 7,8, 500 мМ NaCl, 20 мМ. имидазол, элюированный 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, диализ в 20 мМ Трис, рН 7,8, 100 мМ KCl, 1 мМ ДТТ, заморожен в жидком азоте и хранится при -80°С. EGFP-Vh дополнительно центрифугировали при 300 000 ×  г в течение 30 мин, очищали гель-фильтрацией (Superdex 200, 16/60, GE Healthcare) в 20 мМ Трис, рН 7,5, подвергали диализу в 20 мМ Трис, рН 7.8, 100 мМ KCl, замороженные в жидком азоте и хранящиеся при температуре –80 °C.

    Актин был очищен из ацетонового порошка скелетных мышц кролика. После циклов полимеризации и деполимеризации актин подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex G-200 (GE Healthcare) в 5  мМ Tris pH 7,8, 0,2 мМ АТФ, 0,1 мМ CaCl ₂ , 1 мМ DTT. Актин был помечен Alexa Fluor 488, 594 и 647 сукцинимидиловым эфиром (Invitrogen) ²² . Миозин II экстрагировали из скелетных мышц кролика в буфере, содержащем 500 мМ KCl, 100 мМ K ₂ HPO ₄ . После измельчения и центрифугирования осадок, содержащий актин, отбрасывают. Супернатант подвергают циклам преципитации в буфере с низким содержанием солей, центрифугированию и ресуспендированию в буфере с высоким содержанием солей. Наконец, белок подвергали диализу в 20 мМ KH ₂ PO ₄ /K ₂ HPO ₄ pH 7,5, 500 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА и хранили при -20 % 50°C после добавления глицерола 50°C. .

    Подготовка проб для анализа in vitro

    Микроструктурирование было выполнено путем модификации существующего метода следующим образом ^53,54 .Покровные стекла (22 мм × 32 мм, Thermo Scientific/Menzel-Glaser) сначала промывали водой MillQ и этанолом, обрабатывали ультразвуком и облучали в течение 1 мин под глубокой УФ-лампой (Ossila). Покровные стекла инкубировали в течение 2 часов в 0,1 мг мл ^-1 PLL-g-PEG (SuSoS), растворенного в 10 мМ HEPES, pH 7,8, и промывали водой MillQ. Хромокварцевая фотомаска (Toppan, Франция) с дисками диаметром 5 мкм, равномерно расположенными через 30 мкм (рис. 1а), очищалась глубоким УФ-облучением в течение 1 мин, помещалась на PLL-g-PEG- покровное стекло с покрытием и подвергали воздействию глубокого УФ-излучения в течение 3 мин.Камера была изготовлена ​​из покровного стекла с микроузором, прикрепленного к предметному стеклу (Super Frost, Thermo Scientific) с помощью двусторонней клейкой ленты. Объем типичной камеры составлял 50 мкл. Камеру сначала инкубировали с талином (1 мкМ) в течение 5 минут при комнатной температуре. Несвязанный талин отмывали 200 мкл F-буфера (10 мМ Трис, рН 7,8, 25 мМ KCl, 1 мМ MgCl ₂ , 0,2 мМ CaCl ₂ , 1 мМ ДТТ). Поверхность дисков пассивировали 100 мкл F-буфера, содержащего 10% БСА, в течение 5 мин при комнатной температуре и промывали 200 мкл F-буфера.Наконец, добавляли 100 мкл реакционной смеси и камеру закрывали VALAP (смесь вазелина, ланолина и парафина, 1:1:1). Типичная реакция содержала: 2,4 мкМ актина (содержащего 1 % Alexa647-меченого или 2 % Alexa488-меченого или 2 % Alexa561-меченого актина), 50 нМ миозина II, 1 % BSA, смесь солей (2 мМ MgCl ₂ , 0,2 мМ EGTA и 25 мМ KCl) и регенерирующая смесь АТФ (2 мМ АТФ, 2 мМ MgCl ₂ , 10 мМ креатинфосфат, 3,5 ЕД/мл креатинкиназы) в буфере G-fluo (10 мМ Трис, pH 7). .8, 0,2 мМ CaCl ₂ , 0,4% метилцеллюлозы, 5 мМ DABCO и 20 мМ DTT). Также были добавлены дополнительные белки, такие как EGFP-Vh и mCherry-RIAM 1-306. Покрытые гельзолином актиновые филаменты, используемые на дополнительном рисунке 3, были приготовлены путем смешивания гельсолина, покрывающего зазубренные концы, с актиновыми филаментами в молярном соотношении 1:600 ​​гельзолин/актин ²² .

    Наблюдения под микроскопом

    Изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Ti Eclipse E, оснащенного масляным иммерсионным объективом с увеличением 60X (апохромат, 1.49 NA) и подключается к камере sCMOS (Photometrics, Prime 95B или Hamamatsu, Orca Flash04) с использованием режима вращающегося диска (Yokogawa CSU-X1-A1) или режима TIRF. EGFP-Vh (или Alexa488-Actin), mCherry-RIAM 1-306 (или Alexa594-actin) и Alexa647-actin возбуждали лазерами с длиной волны 488, 561 и 642 нм соответственно.

    Анализ данных

    Изображения были получены с помощью MetaMorph и проанализированы с помощью ImageJ. Для стационарных данных каждая точка точечных диаграмм представляет собой среднюю флуоресценцию одного диска (за вычетом фона).Полоса указывает среднее значение. Кинетика получена путем усреднения кинетики в большом количестве одиночных дисков, после вычитания фона, нормализации и синхронизации по максимальному значению mCherry-RIAM для каждого диска (рис. 3д-ж, 4д, ж), только синхронизация (рис. 4d, f) или только вычитание фона (рис. 2e – g, 5d, e и дополнительный рисунок 5b, c).

    Аффинность RIAM к конструкциям талина была получена путем построения графика средней флуоресценции RIAM в большом количестве дисков, покрытых талином, в зависимости от общей концентрации RIAM (рис.1с). Поскольку мы предполагали, что количество талина в дисках пренебрежимо мало по сравнению с общей концентрацией РИАМ в растворе, мы оценили величину К _d как концентрацию РИАМ при половинном насыщении. Обратите внимание, что это предположение может только недооценивать сродство.

    Графики собраны с помощью Igor Pro или Kaleidagraph. Статистический анализ проводили с использованием теста Стьюдента t в Microsoft Excel. Опыты воспроизводились от 2 до 11 раз с теми же выводами.

    Сводка отчета

    Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчета об исследовании природы, связанной с этой статьей.

    Репортеры на основе FRET для прямой визуализации изменений концентрации и распределения абсцизовой кислоты в арабидопсисе

    1) Определить, способны ли трансгенные линии, экспрессирующие сенсоры, сообщать об эндогенных изменениях концентрации АБК. Этот эксперимент не является слишком обременительным, поскольку трансгенные линии уже существуют, и, как отмечает рецензент, «обработка проростков маннитом вызовет эндогенный синтез АБК, и ее можно использовать в быстром/простом эксперименте, чтобы доказать, что датчики полезны для измерения изменений в эндогенных Содержание ABA .

    Согласно недавним исследованиям, концентрации АБК в корнях и побегах увеличиваются через несколько часов после обработки стрессом (Ikegami et al. , 2009; Geng et al., 2013). Более ранние исследования с использованием замыкающих клеток, вскрытых вручную, измеряли увеличение концентрации АБК в замыкающих клетках через 15 минут после пассивного обезвоживания листьев (Harris and Outlaw, 1991). ABAleon2.1 обнаружил повышение эндогенной концентрации АБК в замыкающих клетках через 15 минут после снижения влажности (рис. 9А, В) и через 4 ч после обработки 100 мМ NaCl (рис. 9С, D).Интересно, что обработка сорбитом в концентрации 300 мМ в течение 4 ч не вызывала увеличения АБК в замыкающих клетках (рис. 9C, D). Когда пятидневные проростки обрабатывали в течение 6 часов, как NaCl, так и сорбит вызывали увеличение концентрации АБК в корнях (рис. 9E-H). Эти эксперименты теперь описаны и обсуждаются в рукописи (Аннотация; Результаты; третий абзац раздела «Обсуждение», озаглавленного «Анализ изменений концентрации АБК и транспорта АБК на большие расстояния у арабидопсиса»).

    2) Определить, проявляют ли трансгенные линии, экспрессирующие сенсоры, измененную чувствительность к экзогенной АБК. Поскольку сенсоры связываются с ABA и, возможно, с другими эндогенными белками, необходимыми для передачи сигнала ABA, возникает вопрос, проявляют ли растения, экспрессирующие сенсоры, измененную чувствительность к ABA. Опять же, этот эксперимент не слишком обременительный; например, могут быть использованы прямые анализы ингибирования роста. Как отмечает рецензент: «Я не думаю, что линии должны иметь 100 % чувствительность ABA к дикому типу, чтобы быть полезными. Было бы идеально, если бы это было так, но ключевым моментом является знание присущих им свойств и ограничений, а также предостережений, связанных с их использованием .

    Мы благодарим рецензентов за предложение этих экспериментов. Фенотипический анализ был проведен с двумя линиями ABAleon2.1 (линия 3 и линия 10), которые экспрессируют ABAleon2.1 на разных уровнях (рис. 5А). Эти линии сравнивали с линиями сверхэкспрессии Col-0 дикого типа, YFP-PYR1 и abi1-3 /YFP-ABI1 (Nishimura et al., 2010) в анализах чувствительности ABA (рис. 5). В анализах ABA-индуцированного закрытия устьиц обе линии ABAleon2.1 проявляли ответы на ABA, которые были сопоставимы с растениями дикого типа Col-0 (фиг. 5J).Однако обе линии ABAleon2.1 проявляли пониженную чувствительность к АБК в тестах на прорастание семян, рост семядолей и рост проростков (рис. 5B-I). Интересно, что степень чувствительности к АБК в обеих линиях коррелировала с уровнями экспрессии ABAleon2.1, которые определяли с помощью количественной флуоресцентной микроскопии (рис. 5А). По сравнению с abi1-3 /YFP-ABI1, чувствительность к АБК растений ABAleon2.1 была сходной в анализах роста проростков (рис. 5D, E, I), но меньше влияла на прорастание семян и анализы роста семядолей (рис. 5B, С, ФХ).Более высокая интенсивность флуоресценции обеих линий ABAleon2.1 по сравнению с abi1-3 /YFP-ABI1 указывает на то, что ABAleon2.1 гораздо более экспрессирован, чем YFP-ABI1. На основании того, что ABAleon2.1 не проявляет фосфатазной активности in vitro (рис. 1H) и что степень чувствительности к АБК коррелирует с уровнями экспрессии ABAleon2.1, снижение чувствительности к АБК растений ABAleon2.1 (рис. 5) может привести к от ABAleon2.1, опосредованного удалением физиологически значимых концентраций ABA в определенных тканях.Мы считаем, что у любого метода есть свои ограничения, и что полезно проанализировать их, как сейчас, в этом исследовании. Актуальность, ограничение и возможный механизм снижения чувствительности ABAleon2.1 к АБК теперь описаны и обсуждаются в рукописи (Аннотация; раздел «Результаты», озаглавленный «Растения арабидопсиса, экспрессирующие ABAleon2.1, гипочувствительны к АБК; последний абзац раздела «Обсуждение», озаглавленный «Дизайн ABAleon журналисты»).

    Хотя мы не обменивались рукописями с лабораторией Фроммера, краткие сообщения сообщают нам, что их репортеры устроены по-другому, имеют другой динамический диапазон и дополнительный диапазон определения концентрации АБК.Основываясь на этих различиях, два класса репортеров ABA, разработанные и проанализированные нашими соответствующими лабораториями, могут использоваться для различных аспектов биологии ABA и могут дополнять друг друга.

    Другие выпуски:

    3) Авторы показывают очень четкую кривую титрования чувствительности к pH, показывающую независимость сенсора от pH выше pH 7,0. Некоторое обсуждение ожидаемых изменений pH в ответ на ABA было бы полезно, чтобы поместить эту зависимость pH в контекст полезности датчика .

    Известно, что АБК

    вызывает подщелачивание цитоплазмы замыкающих клеток. Теперь мы обсудим предыдущую литературу, показывающую это, и обсудим стабильность ABAleon в этом диапазоне pH, как было предложено (пятый абзац раздела «Обсуждение», озаглавленного «Анализ изменений концентрации АБК и транспорта АБК на большие расстояния у Arabidopsis»).

    4) В Рисунок 3A похоже, что сигнал акцептора и донора FRET увеличивается после добавления АБК в замыкающую клетку. Вы ожидаете, что сигнал донора будет расти, а сигнал акцептора падать по мере увеличения уровня ABA.Означает ли это, что за период времени эксперимента произошел значительный синтез сенсора?

    Изучение данных визуализации показало, что увеличение эмиссии акцептора при анализе замыкающих клеток на рисунке 3A-C было вызвано небольшим дрейфом образца. Хотя известно, что АБК индуцирует экспрессию некоторых PP2C и подавляет экспрессию некоторых PYR/PYL/RCAR (Leonhardt et al., 2004; Santiago et al., 2009; Szostkiewicz et al., 2010), АБК-зависимая экспрессия ABAleon2 .1 скорее маловероятно. ABAleon2.1 экспрессировался под контролем промотора pUBQ10, который не зависит от АБК (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi; Winter et al., 2007). Не ожидается, что значительные изменения уровней белка ABAleon2.1 произойдут в течение периода времени экспериментов на рисунке 3. В случае синтеза белка de novo вновь синтезированные белки ABAleon2.1 не повлияют на логометрические измерения в временные рамки экспериментов на рисунке 3, поскольку время созревания mTurquoise составляет> 1 часа (Goedhart et al., 2010). Мы добавили текст к подписи к рисунку, отметив, что небольшой дрейф образца способствовал сигналам флуоресценции на рисунке 3A.

    5) Существует довольно много работ, в которых предпринимались попытки оценить уровни АБК в отдельных типах клеток, например, в рукописи из лаборатории Вейлера были сделаны оценки замыкающих клеток после стресса ( Harris et al. 1988 ). Я думаю, что старую литературу по этой теме следует цитировать и обсуждать во Введении и обсуждении .

    Спасибо за этот комментарий. Этот раздел включен во Введение: «В ответ на ограничения по воде концентрации АБК увеличиваются (Harris et al., 1988; Harris and Outlaw, 1991; Christmann et al., 2007; Forcat et al., 2008; Ikegami et al. , 2009; Geng et al., 2013) и уменьшаются при снятии стресса (Harris and Outlaw, 1991; Endo et al., 2008)».

    Этот раздел был включен в Обсуждение: «В замыкающих клетках Vicia faba концентрации АБК были ~ 0.7 фг/пара клеток в неподверженных стрессу и ~17,7 фг/пару клеток в стрессированных замыкающих клетках (Harris et al., 1988). Концентрация АБК в замыкающих клетках, подвергшихся стрессу, оценивалась примерно в 15 мкМ (Harris et al., 1988; Harris and Outlaw 1991). Экстраполируя эти значения, концентрация АБК замыкающих клеток без стресса будет составлять ~ 500 нМ. Такие приближения будут согласовываться с частичным насыщением и сниженным ответом ABAleon2. 1 в замыкающих клетках (рис. 3A-C) и с сильной экспрессией ABA-индуцированного репортера pRAB18-GFP (рис. 2 — дополнение к рисунку 1).

    В дополнение к запрошенным точкам мы включили новый рисунок (рис. 8), на котором были исследованы АБК-индуцированные ответы низкоаффинных ABAleon (ABAleon2.13, ABAleon2.14 и ABAleon2.15) в зоне созревания корней. трансгенных растений арабидопсиса. Эти анализы демонстрируют полезность ABAleon2.15 (K’ _d ~ 600 нМ), который может дополнять высокоаффинный ABAleon2.1 (K’ _d ~ 100 нМ) (раздел результатов, озаглавленный «Отчеты о низкоаффинном ABAleon2.15). Поглощение АБК корнями»).

    https://doi.org/10.7554/eLife.01739.023 .