Тюнинг лада 2108: Запрашиваемая страница не найдена! | Тюнинг-Дизайн

Содержание

«Лада-2108»: тюнинг салона и экстерьера

Для начала немного истории. Старт серийного производства автомобилей ВАЗ «восьмого» семейства стартовал на Волжском заводе почти 30 лет назад – в 1984 году. Именно тогда с конвейера сошла первая «Лада» 2108-й модели. На то время это был самый прогрессивный в СССР хетчбек, который поражал всех своей хорошей манёвренностью и управляемостью. Динамические характеристики данного автомобиля тоже не отставали от тогдашних требований.

Что касается 21-го века, то сейчас «Лада-2108» серийно не выпускается – в 2005 году на её смену пришло второе поколение «Самары» под названием ВАЗ-2113, которое отличалось более современным дизайном и новым салоном. Но тем не менее в России эту машину не забывают, и она до сих пор пользуется высоким спросом у автомобилистов, особенно у любителей тюнинга. Из-за своей невысокой стоимости «Лада-2108» стала самым популярным спорт-каром у молодёжи. И действительно, благодаря особой форме кузова и доступности тюнинг-комплектов из унылой «восьмёрки» можно сделать нечто спортивное и изысканное. В данной статье мы рассмотрим несколько способов доработок хэтчбека под названием «Лада-2108».

Тюнинг внешнего облика

Нередко автомобилисты называли данный автомобиль «зубилом» из-за характерной формы кузова. Для того чтобы избавить его от такой клички, достаточно просто установить более аэродинамический бампер, желательно с алюминиевой сеткой (чтобы лишние камни не испортили техническое состояние радиатора) и большим воздухозаборником, чтобы охлаждать мотор в нужном объёме, а также новый спойлер.

Таким образом, у вас получится некая ВАЗ-2108 «Лада-аэро». Далее после улучшенных характеристик аэродинамики можно приступать к оптике фонарей. Здесь перед водителем открывается сотня всевозможных вариантов исполнения задних стоп-сигналов и передних фар основного света. Но лучше всего выбирать только те комплекты, которые прошли специальную сертификацию у автозавода. Таким образом, ваша светотехника будет не только красивой, но и видной для всех остальных участников движения. Установку тонированных стоп-сигналов лучше не рассматривать, поскольку в вас могут въехать другие водители, не заметив нужную яркость ламп. Спереди лучше всего установить так называемую альтернативную оптику. Она не только хорошо осветит дорогу, но и заставит других участников движения обращать внимание на ваше авто.

«Лада-2108»: тюнинг салона

После всего этого можно смело приступать к тюнингу интерьера. Как известно, главным недостатком отечественной «Лады» является её тесное салонное пространство. Для того чтобы хоть чуть-чуть прибавить лишнего места внутри, нужно установить более современную европанель и заняться установкой новых сидений. Также одним из недостатков хэтчбека «Лада-2108» является его укороченная ручка переключения передач. Эту недоработку можно легко устранить путём установки более габаритной ручки. Найти её можно в автомагазине или на рынке. Не помешает хетчбеку и дополнительный свет. Желательно сделать светодиодную подсветку и заменить панель приборов на цифровую. И завершает весь этот процесс установка новой шумоизоляции.

ВАЗ 2108 — лучший объект для тюнинга. Часть первая

15.11.2017, Просмотров: 3556

Лада 2108 – это автомобиль Волжского автомобильного завода, который открыл эпоху переднеприводного семейства ВАЗ. Этот трехдверный хетчбек начал выпускаться в 1984 году и пользовался бешеной популярностью среди советских покупателей, и до сих пор покоряет просторы СНГ.

С каждым днем «восьмерок» становится все меньше, так как они выпускались 19 лет, так же Лада 2109 была более популярна, и отличает их наличие 5 дверей у «девятки». Сегодня 2108 часто приобретают в качестве первого автомобиля, который может научить водить и чинить машину, да и стоимость их на вторичном рынке в неплохом состоянии начинается от 800уе.

Почему «восьмерка» лучший скелет для тюнинга

Лада является уникальной машине в плане тюнинга, так как это единственная марка, где на каждую деталь, механизм или узел есть тюнинговый аналог, имеющий лучшие характеристики, в том числе и повышенную надежность.

2108 хороший объект для тюнинга, по следующим причинам:

  • Стоимость автомобиля с «живым» кузовом очень низкая
  • Жесткость кузова на скручивание равна 8200 Нм/град (у 2109 6800 Нм/град)
  • Максимально широкий диапазон деталей для тюнинга на самый разный вкус и бюджет
  • Поднятие мощности мотора при максимально низком бюджете
  • Широкая взаимозаменяемость запчастей с современными автомобилями ВАЗ (110 семейство, Priora)
  • Площадка для воплощения самых разных идей тюнинга и стайлинга

Именно вышеперечисленными факторами пользуются люди, которые прибегают к совершенствованию своего автомобиля.

Рассмотрим каждый агрегат и узел, который можно усовершенствовать, это будут:

  • Кузов
  • Двигатель
  • Трансмиссия
  • Ходовая часть
  • Тормоза
  • Рулевое управление
  • Усиление каркаса кузова
  • Электрооборудование
  • Интерьер
Кузов 2108

Кузов 2108 имеет прочную конструкцию благодаря отсутствию задних дверей. В первую очередь необходимо побороться с очагами коррозии, так как устойчивость к коррозии отечественных автомобилей желает оставлять лучшего. Что бы внешне машина выглядела – желательно обновить краску. Расход лакокрасочных материалов сравнительно небольшой, так как машина небольшая, а площадь окрашиваемой поверхности небольшая.

На сегодня существуют методы облегчения кузова, это готовые стеклопластиковые капоты, передние крылья и крышки багажника, которые в первую очередь страдают от коррозии. Установка стеклопластиковых деталей позволит облегчить кузов, а так же устранить появление коррозии на этих деталях навсегда.

Для тех, кто не хочет оставлять стандартные бампера, существуют готовые аэродинамические комплекты обвеса из стекловолокна, стоимость которых достигает максимум 200$, и в их комплект входит передний и задний бамперы и боковая накладка порога.

Что касается оптики, то выбор фар и фонарей так же широк. Компания ProSport выпускает широкую линейку оптики для ВАЗа, поэтому остается лишь выбирать по вкусу.

Двигатель

Изначально Лада 2108 оснащена моторами 1.1, 1.3 и 1.5 литра с карбюраторным впрыском топлива. Если же бюджет слишком мал, а повысить мощность хочется, то ниже будет перечислен план повышения мощности карбюраторного мотора:

Расточка цилиндров до высшего объема;

  • Установка коленвала от «Калины», что бы с поршневой 82.0…82.8мм ход поршня был75,6, в итоге составит объем 1.6 литра;
  • Облегчение маховика;
  • Расточка впускных и выпускных каналов ГБЦ, установка облегченных клапанов и тарелок;
  • Установка распредвала с широкими фазами и высоким подъемом кулачка;
  • Монтаж двухконтурной системы зажигания;
  • Прямоточная система выхлопа;
  • Установка карбюратора Solex 21073 с расточкой диффузоров.

Все в сумме даст хорошие динамичные характеристики, но вскоре этой мощности будет недостаточно, поэтому владельцы переднеприводных «зубил» идут путем установки 16 клапанного двигателя от 2112 или «Приоры».

Двигатель 21126 имеет в стоке 98 л.с. благодаря 16-клапанной головке и облегченной шатунно-поршневой группе, но конструкция блока имеет начало от 2108, поэтому без проблем устанавливается на «восьмерку», трудности лишь составит подрезка передней панели, так как двигатель будет завален наперед. Так же большим преимуществом является то, что разработчикам удалось добиться соотношения R/S близкого к идеальному (1,709). Установка двигателя от «Приоры» позволит разгонять «зубило» за 11 секунд, сохраняя ресурс мотора. Если же этого будет недостаточно, то мощность этого мотора можно увеличить до 400 л.с. Так как часто тюнинг ВАЗа бюджетный, рассмотрим повышение мощности мотора 21126 с минимальными вложениями, где мощность будет порядка 150-160 л.с., при этом ресурс упадет незначительно.

Способы тюнинга 16 клапанного мотора
  • Установка кованых поршней, размером 82.5мм;
  • Поршневые кольца фирмы Mahle, позволяющие держать компрессию выше заводских значений;
  • Установка распредвалов с более широкой фазой, что бы полка момента была между 2000-6000 оборотами коленвала в минуту;
  • Впускной коллектор с лучшей формой для максимально правильной подачи воздуха в цилиндры;
  • Увеличенная дроссельная заслонка;
  • Форсунки от «Волги», позволяющие в средней нагрузке «прокормить» тюнинговы мотор;
  • Полный комплект прямоточной выхлопной системы;
  • Прошивка блока управления двигателя онлайн.

Немаловажно то, что подушки крепления двигателя и КПП нужно ставить усиленные, так как при повышении мощности вибрация будет передаваться сильнее. Вышеперечисленный способ повышения мощности подходит для городского автомобиля, который будет постоянно впереди всего потока машин. Более дорогой метод повышения мощности автомобиля в 2-4 раза, это либо установка четырехдроссельной системы впуска, либо монтаж турбины.

Установка дросселей является спорным моментом, так как имеет сильные недостатки:

  • Нестабильный холостой ход
  • Сложность подключения ВУТ к коллектору
  • Высокая вероятность попадания больших частиц пыли и грязи в цилиндр
  • Большой расход топлива

Из-за установки широкофазных распредвалов под дросселя приведет к нестабильной работе двигателя и детонации, поэтому такой метод повышения мощности применяется чаще на кольцевых гонках. Установка турбо так же имеет ряд недостатков:

  • Высокая стоимость (1500уе полный комплект).
  • Такая система требует частого обслуживания и постоянного контроля за температурой выхлопных газов, соотношения бензина и воздуха, и слежка за своевременном сбросе давления турбины при переключении передач.

Достоинства:

  • До 2000-3000 оборотов мотор не проявляет явных признаков большой мощности, и поэтому по передвижение по городу весьма удобное.
  • Расход топлива остается небольшим (10-12литров) при мощности 200-250 л.с.

Большой запас мощности.

Продолжение следует…

Тюнинг подвески ВАЗ 2108-2109, ВАЗ 2110-2112 и ВАЗ 2113-2115 своими руками

Очень часто владельцы автомобилей марки ВАЗ стараются внести в их конструкцию разного рода усовершенствования, чтобы улучшить их эксплуатационные характеристики.

Это различные изменения в конструкции мотора, тормозной системы, коробки передач, бампера, колёс и т.п.

Среди всех этих переделок особое место занимает тюнинг подвески ВАЗ — она является одним из определяющих факторов управляемости, ходовых качеств и безопасности на дороге.

Чтобы усовершенствовать подвеску, вы можете обратиться за помощью к специалистам автосервиса или сделать всю работу своими руками. Это поможет вам сократить финансовые расходы и сделать всё так, как вы считаете нужным. Давайте рассмотрим некоторые возможности усовершенствования в различных моделях автомобилей марки ВАЗ.

Тюнинг подвески автомобиля Ваз 2109

Тюнинг подвески в моделях ВАЗ 2101—2107

Недостаток передней и задней подвески ВАЗ 2107 и в автомобилях этой группы в том, что она слишком мягкая. Это создаёт определённые неудобства, особенно при полной загрузке. Колёса цепляют арки, что существенно затрудняет движение.

Хорошим выходом из положения является установка на передней подвеске пружин от автомобиля «Нива 2121» — они хорошо подходят по размеру. Они придадут необходимую жёсткость, и авто при полной загрузке перестанет проседать. Такие пружины могут подойти не только для передней, но и для задней подвески. Кроме того, надо будет заменить резиновые отбойники.

Далее будет необходимо заменить амортизаторы, что также может улучшить ходовые качества авто. Лучше всего выбрать газомаслянные — неподвижность штока придаст больше упругости передней части машины.

Однако следует учесть, что после замены пружин и амортизаторов есть высокая вероятность того, что увеличится крен вашего авто на поворотах. Чтобы его минимизировать, установите стабилизаторы поперечной устойчивости повышенной жёсткости — они хорошо решают подобные проблемы.

Двойной передний стабилизатор на автомобили Ваз 2101 – 2107

Ещё одним средством улучшения своими руками ситуации являются треугольные рычаги. Они используются для более точной настройки. Рычаги дают возможность установки отрицательного развала. При этом вам не потребуется замена нижних болтов, которые осуществляют крепление к балке.

Кроме того, устанавливая треугольные рычаги, вы получаете возможность увеличить кастор – угол продольного наклона оси поворота колеса. Это помогает ощутимо улучшить управляемость вашей машины.Однако, устанавливая рычаги, вы должны будете отрегулировать развал-схождение. Кроме того, вам понадобятся косточки стабилизатора ВАЗ 2110.

Чтобы придать вашей машине большей устойчивости, вы можете обеспечить ей более низкую посадку. Для этого используется задняя поперечная тяга — она позволит вам выполнить регулировку моста относительно кузова.

Тюнинг подвески автомобиля Ваз 2101

Тюнинг подвески ВАЗ 2108—2109

У «восьмёрки» и «девятки», по сути, те же методы улучшения, что и в предыдущем разделе. Можно порекомендовать внести своими руками следующие изменения:

  • установить стабилизатор поперечной устойчивости от ВАЗ 2110 — он поможет снизить крен на поворотах;
  • спереди поставить газовые амортизаторы Plaza;
  • сделать минусовой развал колёс;
  • увеличить угол продольного наклона колёс спереди авто.

Это поможет улучшить ходовые качества и управляемость вашего авто.

Тюнинг подвески машины Ваз 2109

Тюнинг автомобилей ВАЗ 2110—2112

Эту группу машин можно совершенствовать по той же схеме, которая описана выше. Или же пойти другим путём — установить своими руками более функциональную подвеску, например, от «Приоры».

Такая подвеска гораздо жёстче, руль лучше слушается водителя, ощущается собранность и чёткость. Особенно хорошо все преимущества заметны при прохождении ямок и впадин при движении автомобиля. Передок при этом становится выше на пару сантиметров.

Некоторые, правда, наоборот ставят подвеску от ВАЗ 2110 на «Приору»: для разных автолюбителей — разные предпочтения. Невозможно придумать какое-нибудь утверждение, с которым все согласятся на 100%.

Тюнинг подвески на автомобиле Ваз 2110

Тюнинг автомобилей ВАЗ 2113—2115

Переднеприводные машины ВАЗ 2113, 2114 и 2115 принято снабжать спортивной подвеской. Она улучшает устойчивость и управляемость во время движения:

  • для начала передние стойки дорабатываем, превращая их из маслонаполненных в газомаслянные. Это делается путём закачивания газа в рабочую камеру. Благодаря этому шток после погружения самостоятельно примет первоначальное положение;
  • чтобы уберечь себя от вылета пружины во время движения, выполняем ограничение хода штока;
  • штатные штоки можно заменить на «кайловеры» — спортивные стойки. Они дадут возможность ниже посадить автомобиль. Это придаст ему устойчивости. При этом используются укороченные пружины, что помогает минимизировать уровень крена машины на поворотах;
  • вышеописанные треугольные рычаги. Обеспечат улучшение управляемости автомобиля, точность настройки подвески и увеличение кастора.

Так мы тюнингуем своими руками подвеску у моделей группы 2113—2115, делая её спортивной. При этом улучшается управляемость, уменьшается крен, и повышается ваша безопасность на дороге во время движения автомобиля.

Заключение

Многие знатоки уверяют, что тюнинг подвески автомобилей марки ВАЗ неизбежен, если вы хотите, чтобы машина хорошо вас слушалась. Для этого вам придётся внести в конструкцию ряд изменений. Они сделают посадку более низкой и устойчивой, руль — послушным, придадут машине упругости и собранности.

 

[democracy]

[democracy]

Автор: Екатерина

Лучшие колки для вашей гитары? ПОЛНОЕ РУКОВОДСТВО!

Способность оставаться в гармонии — одна из самых отличительных черт, отличающих профессиональных гитаристов…

Если вы ищете вместо ваших колков, то вам нужен , чтобы найти лучшую замену. Это потому, что колышки играют решающую роль в том, чтобы ваша гитара оставалась настроенной!

Поздравляем с настройкой гитары!

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Как правильно настроить гитару

Перед каждым начинающим музыкантом встает вопрос: «Как настроить акустическую гитару?» Для начала нужно определиться, во что вы будете играть? Это могут быть пальцы, медиатор, слайд. Производить настройку нужно тем же инструментом, на котором вы будете играть, так как каждый из них с разной силой воздействует на струны.

От того, насколько правильно настроена гитара, зависит качество звучания сыгранной музыкантом мелодии. Поэтому каждый, даже начинающий музыкант, должен уметь настраивать свой инструмент. О том, как правильно настроить гитару, мы расскажем ниже.

В первую очередь нужно уметь настраивать на слух. Благодаря этому методу вы можете настроить за 5-10 минут, даже если вы просто дергали за ниточки.

Наиболее популярным среди начинающих является классический метод. Это довольно просто и интуитивно понятно. Для правильного звучания достаточно тонко настроить одну струну — первую, используя любой подручный механизм. Для того, чтобы понять, как правильно настроить гитару, нужно знать стандартное устройство инструмента.

90 477

Примечание

Строка

Значение

Е

1

второй октавы

B

2

Первая октава

0480

соль Octave первые

D

4

80

Первая октава

5

для Octave Mell

6

6

9 octave Big

для настройки первой строки, вы можно использовать уже настроенный инструмент, например, пианино. За эталон берется нота первой октавы (ми). Также подойдет:

  • программа на смартфон или ПК;
  • камертон
  • — самый точный способ;
  • тон набора соответствует ноте Е.

Необходимо, чтобы струна звучала в унисон со стандартом. Остальное настроить не сложно. Последовательность такая:

— Вторая строка корректируется, опираясь на первую. Его зажимают на пятом ладу и подгоняют так, чтобы он совпадал со звуком первой открытой струны.

— 3-я — зажимается на четвертом ладу и регулируется до совпадения с открытой второй струной.

— 4-й — зажат на пятом ладу, звук должен соответствовать третьему свободному.

— 5-я — зажата на пятом ладу, подогнана под совпадение с четвертой открытой.

— 6-й (самый толстый, верхний), давит на пятый лад и подгоняется до совпадения с пятым открытым. Звучит как первый с разницей в две октавы.

После того, как настройка гитары закончена, лучше всего еще раз пройтись по струнам для регулировки, так как при натяжении одной из них другая может ослабнуть. Если все сделано правильно, ваш инструмент будет настроен практически идеально.

Как правильно настроить гитару.

Это более точный и правильный способ настройки, так как иногда недостаточно просто настроить прибор в режиме. Мигалкой называется прием касания пальцем струны левой руки посередине лада и извлечение звука правой рукой с одновременным снятием пальца со струны.

Последовательность:

— 1-я струна настраивается так же, как и в классическом методе с помощью другого инструмента;

— 6-я струна — с помощью флажка на пятом ладу настраивается на совпадение с открытым первым;

— 5-я струна — настраивается с помощью флажка на седьмом ладу и по звучанию должна соответствовать первому открытому;

— 4-я струна — с помощью флажолета на седьмом ладу, по звучанию должна совпадать с флажолом на пятом ладу пятой струны;

— 3-я струна — с помощью флажка на седьмом ладу соответствует флажку четвертой струны на пятом ладу;

— 2-я струна — с помощью флажолета на пятом ладу настраивается на совпадение с флажолетом первой струны, взятой на седьмом ладу.

Вот несколько способов правильно настроить гитару. Также можно использовать современные методы, такие как настройка онлайн или с помощью тюнера. Однако знание того, как настроить инструмент на слух, всегда будет с вами и поможет, когда под рукой нет ничего, кроме гитары.

(PDF) Прецизионность и достоверность измерений FRET для отдельных молекул — многолабораторное сравнительное исследование

5. Ha, T. et al. Исследование взаимодействия между двумя одиночными молекулами:

резонансный перенос энергии флуоресценции между одним донором и одним

акцептором.проц. Натл акад. науч. США 93, 6264–6268 (1996).

6. Schuler, B., Lipman, E.A., Steinbach, P.J., Kumke, M. & Eaton, W.A.

Полипролин и «спектроскопическая линейка», пересмотренные с помощью флуоресценции одиночной молекулы

. проц. Натл акад. науч. США 102, 2754–2759 (2005).

7. Choi, U.B. et al. Одномолекулярная модель комплекса слияния синаптотагмина

1-SNARE, полученная из FRET. Нац. Структура Мол. биол. 17, 318–384 (2010).

8. Калинин С.и другие. Инструментарий и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничением FRET

. Нац. Методы 9, 1218–1227 (2012).

9. Hellenkamp, ​​B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M. & Hugel, T.

Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемые самосогласованными

FRET Networks. Нац. Методы 14, 174–180 (2017).

10. Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F. & Michaelis, J. Fast-NPS — цепь Маркова .вычисл. физ. коммун. 219, 377–389 (2017).

11. Хофманн, Д., Корцдорфер, Т. и Куммель, С. Перенос энергии и приближение дипольной связи Форстера

исследованы в схеме Кон-Шама

в реальном времени. физ. Ред. А 82, 012509 (2010).

12. Spiegel, JD, Fulle, S., Kleinschmidt, M., Gohlke, H. & Marian, CM Отказ

IDA в системах FRET на близких расстояниях между красителями смягчается

частыми низкими значениями k2 . Дж.физ. хим. Б. 120, 8845–8862 (2016).

13. Sakon, J.J. & Weninger, K.R. Определение конформации отдельных

белков в живых клетках. Нац. Методы 7, 203–205 (2010).

14. Сабанаягам, Ч.Р., Эйд, Дж.С. и Меллер, А. Использование передачи энергии флуоресцентного резонанса

для измерения расстояний вдоль отдельных молекул ДНК:

поправки из-за неидеального переноса. Дж. Хим. физ. 122, 61103–61107 (2005).

15. Макканн, Дж. Дж., Choi, U.B., Zheng, L., Weninger, K. & Bowen, M.E.

Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET из иммобилизованных

одиночных молекул. Биофиз. Журнал 99, 961–970 (2010).

16. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J. & Seidel, C. A. M.

Точные исследования одной молекулы FRET с использованием многопараметрического флуоресцентного детектирования

. Методы Энзимол. 475, 455–514 (2010).

17. Lee, N.K. et al. Точные измерения FRET в пределах одной диффузии

биомолекул с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз. J. 88, 2939–2953 (2005).

18. Кудрявцев В. и соавт. Комбинация MFD и PIE для точных однопарных измерений резонансной передачи энергии Förster

. ChemPhysChem 13, 1060–1078 (2012).

19. Hohlbein, J., Craggs, T.D. & Cordes, T. Возбуждение лазером переменного тока:

одномолекулярный FRET и другие. хим. соц. 43, 1156–1171 (2014).

20. Margeat, E. et al. Прямое наблюдение за абортивной инициацией и ускользанием промотора

в одиночных иммобилизованных транскрипционных комплексах.Биофиз. J. 90,

1419–1431 (2006).

21. Мущелок А. и соавт. Система нанопозиционирования для структурного анализа макромолекул

. Нац. Методы 5, 965–971 (2008).

22. Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J. & Michaelis, J. Количественная структурная

информация по одномолекулярному FRET. Фарадей Обсудить. 184, 117–129 (2015).

23. Dimura, M. et al. Количественные исследования FRET и интегративное моделирование раскрывают

структуру и динамику биомолекулярных систем. Курс. мнение Структура биол.

40, 163–185 (2016).

24. Brunger, A.T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S. & Weninger, K.R. Трехмерное молекулярное моделирование с FRET одной молекулы. Дж. Структура. биол.

173, 497–505 (2011).

25. Craggs, T.D. et al. Конформационная динамика субстрата управляет структурно-специфическим

распознаванием ДНК с гэпом ДНК-полимеразой. Препринт bioRxiv на https://

www.biorxiv.org/content/early/2018/02/10/263038 (2018).

26. Надь, Дж., Эйлерт, Т. и Михаэлис, Дж. Точность и достоверность структурных исследований на основе smFRET

— эталонное исследование системы FAST-Nano-Positioning.

J. Chem. физ. 148, 123308 (2018).

27. Ивани И. и др. Parmbsc1: улучшенное силовое поле для моделирования ДНК.

Нац. Методы 13, 55–58 (2016).

28. Neubauer, H. et al. Ориентационная и динамическая гетерогенность родамина

6G, терминально присоединенного к спирали ДНК, обнаружена методами ЯМР и одиночной молекулярной

флуоресцентной спектроскопии. Варенье. хим. соц. 129, 12746–12755 (2007).

29. Iqbal, A. et al. Ориентационная зависимость флуоресцентного переноса энергии между

Cy3 и Cy5, присоединенными на конце к двухцепочечным нуклеиновым кислотам. проц.

Нац. акад. науч. США 105, 11176–11181 (2008 г.).

30. Peulen, T. O., Opanasyuk, O. & Seidel, C. A. M. Сочетание графических и

аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа

FRET-измерений меченых макромолекул с временным разрешением.Дж. Физ. хим. В

121, 8211–8241 (2017).

31. Дигман, М. А., Кайолфа, В. Р., Замаи, М. и Граттон, Э. Фазорный подход

к анализу изображений времени жизни флуоресценции. Биофиз. Дж. 84, Л14–Л16 (2008).

32. Капанидис А.Н. и соавт. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий

путем возбуждения одиночных молекул переменным лазером.

Проц. Натл акад. науч. США 101, 8936–8941 (2004).

33.Мюллер Б. К., Зайчиков Э., Бройхле К. и Лэмб Д.К. Импульсное чередующееся возбуждение

. Биофиз. J. 89, 3508–3522 (2005).

34. Возняк А. К., Шредер Г. Ф., Грубмюллер Х., Зайдель С. А. М. и

Остерхельт Ф. Одномолекулярный FRET измеряет изгибы и перегибы в ДНК.

Проц. Натл акад. науч. США 105, 18337–18342 (2008 г.).

35. Стельцл, Л. С., Эрленбах, Н., Хайнц, М., Приснер, Т. Ф. и Хаммер, Г. Разрешение

конформационной динамики ДНК с разрешением Ангстрема с помощью импульсного

электрон-электронного двойного резонанса и молекулярной динамики.Варенье. хим.

Соц. 139, 11674–11677 (2017).

36. Левитус М. и Ранджит С. Цианиновые красители в биофизических исследованиях:

фотофизика полиметиновых флуоресцентных красителей в биомолекулярных средах.

Q. Rev. Biophys. 44, 123–151 (2011).

Благодарности

Мы благодарим лабораторию Eaton за ранние измерения, которые помогли нам разработать это исследование. Мы

благодарим Т. Пеулена, М. Димуру и Р. Макдональда за стимулирующие дискуссии по измерениям FRET

, анализу данных и моделированию, а также Б.Булат для измерения флуоресценции

Квантовые выходы

Атто 550 и 1-мид (Атто 550). Мы также благодарим компанию Atto-Tec

за предоставление эталонного образца красителя Atto 550 для характеристики флуоресценции.

Авторы признательны за сетевую поддержку доктору Вильгельму Генриху и Эльзе

Heraeus Foundation и COST Action CM1306 «Понимание движения и

механизма в молекулярных машинах». Идея всемирного эталонного исследования стандартных линеек FRET

возникла на 512-м семинаре WE Heraeus «Кинетика одиночных молекул

» (Бад-Хоннеф, Германия, 2012 г.) и получила дальнейшее развитие в ходе международного симпозиума

COST «Интеграция спектроскопических и теоретических методы анализа

молекулярных машин» (Замок Рингберг, Германия, 2014).

Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC; соглашение о предоставлении гранта

№№ 261227 (для ANK), 646451 (для EL), 638536 (для TC), 671208 (для CAMS) и

681891 (для T. Hugel)), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (предоставить MI 749/4-1

JM, предоставить TI 329/10-1 PT и предоставить SCHL 1896/3-1 MS), Швейцарский национальный

Научный фонд (до BS), Федеральное министерство образования и исследований Германии

(BMBF; 03Z2EN11 до M.S.), Исследовательский фонд Фландрии (FWO; грант G0B4915N

Дж. Хендриксу), Агентство инноваций в области науки и технологий (IWT Flanders;

докторская стипендия NV), Датский совет по независимым исследованиям (Sapere

Грант Aude 0602-01670B для VB), Фонд Novo Nordisk (от NNF15OC0017956 до

VB), BBSRC Великобритании (грант BB/H01795X/1 для ANK), Национальный институт психического здоровья

(грант MH081923 для MEB), Clemson University (начальные средства по номеру

H.Sanabria, SRA и ISY-O.), NIH (гранты GM109832 и GM118508 до

южнокорейских вон; грант GM112659 для T. Ha), NSF (Career Award MCS1749778 до H.

Sanabria), Carl-Zeiss- Stiftung (докторская стипендия в EK), Stipendienstiftung

Rheinland-Pfalz (докторская стипендия в GK), Брауншвейгская международная школа метрологии

(B-IGSM; to BW), Исследовательская учебная группа DFG (GrK1952/1

«Метрология сложных наносистем» на Б. W.), Университет Шеффилда (стартовый фонд

для T.D.C.) и Национальный исследовательский фонд Кореи, финансируемый Министерством науки и ИКТ

(NRF-2017R1A2B3010309 для NKL).

Вклад авторов

Б. Хелленкамп, Т. Хьюгель, Дж.М. и C.A.M.S. разработал исследование; Б. Хелленкамп, SS,

OD, OO, RK, SRA, BA, MA, AB, HC, TE, CF, CG, GG, PH, CAH, AH,

J. Hendrix, LLH, VH, J. Хольбейн, Б.Hua, EK, J.-YK, GK, BL, JJM, NN-R.,

DN, TN, RQ, NCR, CR, TS, HS, LS, JT, ST, NV, AMV, BW, ISY- О.,

и ТДЦ выполненные измерения; Б. Хелленкамп, С.С. и Т. Хьюгель сравнили

измерений; все вышеупомянутые авторы и VB, MEB, TC, MG, EG,

T. Ha, CGH, ANK, DCL, NKL, EAL, ML, H. Sanabria, H. Seidel, MS, BS,

PT, KRW, JM и CS внесли свой вклад в анализ данных и прокомментировали

рукопись; Б.Hellenkamp, ​​S.S., T.D.C., JM, C.A.M.S. и T. Hugel написали рукопись

в консультации с O.D. и О.О.; и О.Д. выполнены расчеты

модельных расстояний.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Дополнительная информация доступна для этого документа по адресу https://doi.org/10.1038/

s41592-018-0085-0.

Информация о перепечатке и разрешениях доступна на сайте www.Nature.com/reprints.

Корреспонденцию и запросы на материалы следует направлять в J.M. или C.A.M.S. или

В.Д.С. или Т.Х.

Примечание издателя: Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в

опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons

Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование,

адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в формате

, при условии, что вы укажете авторство первоначальный автор(ы) и источник,

, предоставляют ссылку на лицензию Creative Commons и указывают, были ли внесены изменения.

Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons

статьи, если иное не указано в кредитной строке материала.

Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а предполагаемое использование

не разрешено законом или превышает разрешенное использование, вам потребуется

, чтобы получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии,

посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

НАТУРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ | ТОМ 15 | СЕНТЯБРЬ 2018 | 669–676 | www.nature.com/naturemethods 675

Содержание предоставлено Springer Nature, применяются условия использования. Права защищены

Талин диссоциирует от RIAM и последовательно связывается с винкулином в ответ на действие актомиозина

конструкции кДНК

Все конструкции талина получены из кДНК, кодирующей человеческий талин-1, содержащей С-концевую метку His 6 . Талин R1–R2–R3, соответствующий F2–F3–R1–R2–R3–R13, клонировали в плазмиду pETM с N-концевой меткой StrepTagII и C-концевой His 6 .Эта конструкция была сделана в три этапа. Сначала фрагмент R2–R3 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров 1 и 2 и клонирован в сайты KpnI/BamHI pETM, что привело к промежуточной плазмиде pETM–R2–R3. R13 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров 3 и 4 и клонирован в сайты BamHI/EcoRI pETM-R2-R3, что привело к промежуточной плазмиде pETM-R2-R3-R13. Наконец, F2–F3–R1–R2–R3 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 5 и 6 и клонировали в сайты KpnI/NcoI pETM–R2–R3–R13, что привело к pETM–F2–F3–R1–R2–R3. –R13.Талин R11, соответствующий F2–F3–R11–R13, и талин R7–R8, соответствующий талину F2–F3–R7–R8–R13, клонировали в плазмиду pET-29a(+) с N-концевым StrepTagII и C -терминал Его 6 тег . Талин R7–R8 и R11 были синтезированы Genscript. кДНК, кодирующие талин F2–F3 (талин 196–405), талин F2–F3–R1–R2–R3 (талин 196–911) и талин R1–R8 (талин 196–1659), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием пар праймеров 7–8, 7–9, 7–10 и клонированы в сайты BamH/XhoI, BamHI/EcoRI и BamHI/EcoRI соответственно плазмиды pGEX6P1 (GE Healthcare) с N-концевой меткой GST и C- терминал Его 6 тег . Наши конструкции не включают субдомены F0 и F1 головы (талин 1–195), поскольку эта часть талина снижает качество экспрессии в наших руках и не участвует в связывании RIAM и винкулина. Предварительно существовавшую кДНК, кодирующую человеческий винкулин 1-851, соответствующую Vh, клонировали в сайты SalI/NotI самодельной плазмиды pGEX-6P1-EGFP. кДНК, кодирующую мышиный RIAM 1-306, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 11 и 12 и клонировали в сайты BamHI/XhoI самодельной плазмиды pGEX-6P2-mCherry с С-концевой меткой His 6 .Праймеры, использованные для клонирования конструкций ДНК в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 1.

Очистка белков

Все рекомбинантные белки были экспрессированы в Escherichia coli (BL21 DE3, Invitrogen). После трансформации бактерии выращивали в 4–12 л среды LB, содержащей 0,1 мг мл -1 ампициллина или канамицина, при 37°С до тех пор, пока поглощение не достигало 0,8 при 600 нм. Рекомбинантные белки экспрессировали при добавлении 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактозида в течение 16 часов при 16 °C. После центрифугирования бактериальный осадок подвергали специальной стадии очистки 22 .

Талин R1–R2–R3, R11 и R7–R8 были связаны с Ni-NTA (Ni 2+ -нитрилотриуксусная кислота)-агарозой (Macherey-Nalgene), промыты 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl , 20 мМ имидазол, 1 мМ β-меркаптоэтанол (BME), элюировали 50 мМ Трис, pH 7,8, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, 1 мМ BME, диализ в 20 мМ Трис, pH 7,8, 100 мМ KCl, 1, мМ замораживают в жидком азоте и хранят при температуре -80 °С.

mCherry-RIAM 1-306, талин F2–F3, F2–F3–R1–R2–R3, R1–R8 и EGFP-Vh, содержащие N-концевую метку GST (глутатион-S-трансферазы), были связаны с глутатион-сефароза (GE Healthcare), промыта 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, и элюирована 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl и 50 мМ восстановленного L-глутатиона (Sigma-Aldrich). Для mCherry-RIAM 1-306 и EGFP-Vh GST расщепляли протеазой PreScission (GE Healthcare) в 50 мМ Tris, pH 7,8, и 500 мМ NaCl, а GST удаляли с помощью хроматографии на глутатион-сефарозе. Затем mCherry-RIAM 1-306 и талин F2–F3, F2–F3–R1–R2–R3 и R1–R8 связывали с Ni-NTA-агарозой, промывали 50 мМ Трис, pH 7,8, 500 мМ NaCl, 20 мМ. имидазол, элюированный 50 мМ Трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, диализ в 20 мМ Трис, рН 7,8, 100 мМ KCl, 1 мМ ДТТ, заморожен в жидком азоте и хранится при -80°С. EGFP-Vh дополнительно центрифугировали при 300 000 ×  г в течение 30 мин, очищали гель-фильтрацией (Superdex 200, 16/60, GE Healthcare) в 20 мМ Трис, рН 7,5, подвергали диализу в 20 мМ Трис, рН 7.8, 100 мМ KCl, замороженные в жидком азоте и хранящиеся при температуре –80 °C.

Актин был очищен из ацетонового порошка скелетных мышц кролика. После циклов полимеризации и деполимеризации актин подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex G-200 (GE Healthcare) в 5  мМ Tris pH 7,8, 0,2 мМ АТФ, 0,1 мМ CaCl 2 , 1 мМ DTT. Актин был помечен Alexa Fluor 488, 594 и 647 сукцинимидиловым эфиром (Invitrogen) 22 . Миозин II экстрагировали из скелетных мышц кролика в буфере, содержащем 500 мМ KCl, 100 мМ K 2 HPO 4 . После измельчения и центрифугирования осадок, содержащий актин, отбрасывают. Супернатант подвергают циклам преципитации в буфере с низким содержанием солей, центрифугированию и ресуспендированию в буфере с высоким содержанием солей. Наконец, белок подвергали диализу в 20 мМ KH 2 PO 4 /K 2 HPO 4 pH 7,5, 500 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА и хранили при -20 % 50°C после добавления глицерола 50°C. .

Подготовка проб для анализа in vitro

Микроструктурирование было выполнено путем модификации существующего метода следующим образом 53,54 .Покровные стекла (22 мм × 32 мм, Thermo Scientific/Menzel-Glaser) сначала промывали водой MillQ и этанолом, обрабатывали ультразвуком и облучали в течение 1 мин под глубокой УФ-лампой (Ossila). Покровные стекла инкубировали в течение 2 часов в 0,1 мг мл -1 PLL-g-PEG (SuSoS), растворенного в 10 мМ HEPES, pH 7,8, и промывали водой MillQ. Хромокварцевая фотомаска (Toppan, Франция) с дисками диаметром 5 мкм, равномерно расположенными через 30 мкм (рис. 1а), очищалась глубоким УФ-облучением в течение 1 мин, помещалась на PLL-g-PEG- покровное стекло с покрытием и подвергали воздействию глубокого УФ-излучения в течение 3 мин.Камера была изготовлена ​​из покровного стекла с микроузором, прикрепленного к предметному стеклу (Super Frost, Thermo Scientific) с помощью двусторонней клейкой ленты. Объем типичной камеры составлял 50 мкл. Камеру сначала инкубировали с талином (1 мкМ) в течение 5 минут при комнатной температуре. Несвязанный талин отмывали 200 мкл F-буфера (10 мМ Трис, рН 7,8, 25 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2 , 0,2 мМ CaCl 2 , 1 мМ ДТТ). Поверхность дисков пассивировали 100 мкл F-буфера, содержащего 10% БСА, в течение 5 мин при комнатной температуре и промывали 200 мкл F-буфера.Наконец, добавляли 100 мкл реакционной смеси и камеру закрывали VALAP (смесь вазелина, ланолина и парафина, 1:1:1). Типичная реакция содержала: 2,4 мкМ актина (содержащего 1 % Alexa647-меченого или 2 % Alexa488-меченого или 2 % Alexa561-меченого актина), 50 нМ миозина II, 1 % BSA, смесь солей (2 мМ MgCl 2 , 0,2 мМ EGTA и 25 мМ KCl) и регенерирующая смесь АТФ (2 мМ АТФ, 2 мМ MgCl 2 , 10 мМ креатинфосфат, 3,5 ЕД/мл креатинкиназы) в буфере G-fluo (10 мМ Трис, pH 7). .8, 0,2 мМ CaCl 2 , 0,4% метилцеллюлозы, 5 мМ DABCO и 20 мМ DTT). Также были добавлены дополнительные белки, такие как EGFP-Vh и mCherry-RIAM 1-306. Покрытые гельзолином актиновые филаменты, используемые на дополнительном рисунке 3, были приготовлены путем смешивания гельсолина, покрывающего зазубренные концы, с актиновыми филаментами в молярном соотношении 1:600 ​​гельзолин/актин 22 .

Наблюдения под микроскопом

Изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Ti Eclipse E, оснащенного масляным иммерсионным объективом с увеличением 60X (апохромат, 1.49 NA) и подключается к камере sCMOS (Photometrics, Prime 95B или Hamamatsu, Orca Flash04) с использованием режима вращающегося диска (Yokogawa CSU-X1-A1) или режима TIRF. EGFP-Vh (или Alexa488-Actin), mCherry-RIAM 1-306 (или Alexa594-actin) и Alexa647-actin возбуждали лазерами с длиной волны 488, 561 и 642 нм соответственно.

Анализ данных

Изображения были получены с помощью MetaMorph и проанализированы с помощью ImageJ. Для стационарных данных каждая точка точечных диаграмм представляет собой среднюю флуоресценцию одного диска (за вычетом фона).Полоса указывает среднее значение. Кинетика получена путем усреднения кинетики в большом количестве одиночных дисков, после вычитания фона, нормализации и синхронизации по максимальному значению mCherry-RIAM для каждого диска (рис. 3д-ж, 4д, ж), только синхронизация (рис. 4d, f) или только вычитание фона (рис. 2e – g, 5d, e и дополнительный рисунок 5b, c).

Аффинность RIAM к конструкциям талина была получена путем построения графика средней флуоресценции RIAM в большом количестве дисков, покрытых талином, в зависимости от общей концентрации RIAM (рис.1с). Поскольку мы предполагали, что количество талина в дисках пренебрежимо мало по сравнению с общей концентрацией РИАМ в растворе, мы оценили величину К d как концентрацию РИАМ при половинном насыщении. Обратите внимание, что это предположение может только недооценивать сродство.

Графики собраны с помощью Igor Pro или Kaleidagraph. Статистический анализ проводили с использованием теста Стьюдента t в Microsoft Excel. Опыты воспроизводились от 2 до 11 раз с теми же выводами.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчета об исследовании природы, связанной с этой статьей.

Репортеры на основе FRET для прямой визуализации изменений концентрации и распределения абсцизовой кислоты в арабидопсисе

1) Определить, способны ли трансгенные линии, экспрессирующие сенсоры, сообщать об эндогенных изменениях концентрации АБК. Этот эксперимент не является слишком обременительным, поскольку трансгенные линии уже существуют, и, как отмечает рецензент, «обработка проростков маннитом вызовет эндогенный синтез АБК, и ее можно использовать в быстром/простом эксперименте, чтобы доказать, что датчики полезны для измерения изменений в эндогенных Содержание ABA .

Согласно недавним исследованиям, концентрации АБК в корнях и побегах увеличиваются через несколько часов после обработки стрессом (Ikegami et al. , 2009; Geng et al., 2013). Более ранние исследования с использованием замыкающих клеток, вскрытых вручную, измеряли увеличение концентрации АБК в замыкающих клетках через 15 минут после пассивного обезвоживания листьев (Harris and Outlaw, 1991). ABAleon2.1 обнаружил повышение эндогенной концентрации АБК в замыкающих клетках через 15 минут после снижения влажности (рис. 9А, В) и через 4 ч после обработки 100 мМ NaCl (рис. 9С, D).Интересно, что обработка сорбитом в концентрации 300 мМ в течение 4 ч не вызывала увеличения АБК в замыкающих клетках (рис. 9C, D). Когда пятидневные проростки обрабатывали в течение 6 часов, как NaCl, так и сорбит вызывали увеличение концентрации АБК в корнях (рис. 9E-H). Эти эксперименты теперь описаны и обсуждаются в рукописи (Аннотация; Результаты; третий абзац раздела «Обсуждение», озаглавленного «Анализ изменений концентрации АБК и транспорта АБК на большие расстояния у арабидопсиса»).

2) Определить, проявляют ли трансгенные линии, экспрессирующие сенсоры, измененную чувствительность к экзогенной АБК. Поскольку сенсоры связываются с ABA и, возможно, с другими эндогенными белками, необходимыми для передачи сигнала ABA, возникает вопрос, проявляют ли растения, экспрессирующие сенсоры, измененную чувствительность к ABA. Опять же, этот эксперимент не слишком обременительный; например, могут быть использованы прямые анализы ингибирования роста. Как отмечает рецензент: «Я не думаю, что линии должны иметь 100 % чувствительность ABA к дикому типу, чтобы быть полезными. Было бы идеально, если бы это было так, но ключевым моментом является знание присущих им свойств и ограничений, а также предостережений, связанных с их использованием .

Мы благодарим рецензентов за предложение этих экспериментов. Фенотипический анализ был проведен с двумя линиями ABAleon2.1 (линия 3 и линия 10), которые экспрессируют ABAleon2.1 на разных уровнях (рис. 5А). Эти линии сравнивали с линиями сверхэкспрессии Col-0 дикого типа, YFP-PYR1 и abi1-3 /YFP-ABI1 (Nishimura et al., 2010) в анализах чувствительности ABA (рис. 5). В анализах ABA-индуцированного закрытия устьиц обе линии ABAleon2.1 проявляли ответы на ABA, которые были сопоставимы с растениями дикого типа Col-0 (фиг. 5J).Однако обе линии ABAleon2.1 проявляли пониженную чувствительность к АБК в тестах на прорастание семян, рост семядолей и рост проростков (рис. 5B-I). Интересно, что степень чувствительности к АБК в обеих линиях коррелировала с уровнями экспрессии ABAleon2.1, которые определяли с помощью количественной флуоресцентной микроскопии (рис. 5А). По сравнению с abi1-3 /YFP-ABI1, чувствительность к АБК растений ABAleon2.1 была сходной в анализах роста проростков (рис. 5D, E, I), но меньше влияла на прорастание семян и анализы роста семядолей (рис. 5B, С, ФХ).Более высокая интенсивность флуоресценции обеих линий ABAleon2.1 по сравнению с abi1-3 /YFP-ABI1 указывает на то, что ABAleon2.1 гораздо более экспрессирован, чем YFP-ABI1. На основании того, что ABAleon2.1 не проявляет фосфатазной активности in vitro (рис. 1H) и что степень чувствительности к АБК коррелирует с уровнями экспрессии ABAleon2.1, снижение чувствительности к АБК растений ABAleon2.1 (рис. 5) может привести к от ABAleon2.1, опосредованного удалением физиологически значимых концентраций ABA в определенных тканях.Мы считаем, что у любого метода есть свои ограничения, и что полезно проанализировать их, как сейчас, в этом исследовании. Актуальность, ограничение и возможный механизм снижения чувствительности ABAleon2.1 к АБК теперь описаны и обсуждаются в рукописи (Аннотация; раздел «Результаты», озаглавленный «Растения арабидопсиса, экспрессирующие ABAleon2.1, гипочувствительны к АБК; последний абзац раздела «Обсуждение», озаглавленный «Дизайн ABAleon журналисты»).

Хотя мы не обменивались рукописями с лабораторией Фроммера, краткие сообщения сообщают нам, что их репортеры устроены по-другому, имеют другой динамический диапазон и дополнительный диапазон определения концентрации АБК.Основываясь на этих различиях, два класса репортеров ABA, разработанные и проанализированные нашими соответствующими лабораториями, могут использоваться для различных аспектов биологии ABA и могут дополнять друг друга.

Другие выпуски:

3) Авторы показывают очень четкую кривую титрования чувствительности к pH, показывающую независимость сенсора от pH выше pH 7,0. Некоторое обсуждение ожидаемых изменений pH в ответ на ABA было бы полезно, чтобы поместить эту зависимость pH в контекст полезности датчика .

Известно, что АБК

вызывает подщелачивание цитоплазмы замыкающих клеток. Теперь мы обсудим предыдущую литературу, показывающую это, и обсудим стабильность ABAleon в этом диапазоне pH, как было предложено (пятый абзац раздела «Обсуждение», озаглавленного «Анализ изменений концентрации АБК и транспорта АБК на большие расстояния у Arabidopsis»).

4) В Рисунок 3A похоже, что сигнал акцептора и донора FRET увеличивается после добавления АБК в замыкающую клетку. Вы ожидаете, что сигнал донора будет расти, а сигнал акцептора падать по мере увеличения уровня ABA.Означает ли это, что за период времени эксперимента произошел значительный синтез сенсора?

Изучение данных визуализации показало, что увеличение эмиссии акцептора при анализе замыкающих клеток на рисунке 3A-C было вызвано небольшим дрейфом образца. Хотя известно, что АБК индуцирует экспрессию некоторых PP2C и подавляет экспрессию некоторых PYR/PYL/RCAR (Leonhardt et al., 2004; Santiago et al., 2009; Szostkiewicz et al., 2010), АБК-зависимая экспрессия ABAleon2 .1 скорее маловероятно. ABAleon2.1 экспрессировался под контролем промотора pUBQ10, который не зависит от АБК (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi; Winter et al., 2007). Не ожидается, что значительные изменения уровней белка ABAleon2.1 произойдут в течение периода времени экспериментов на рисунке 3. В случае синтеза белка de novo вновь синтезированные белки ABAleon2.1 не повлияют на логометрические измерения в временные рамки экспериментов на рисунке 3, поскольку время созревания mTurquoise составляет> 1 часа (Goedhart et al., 2010). Мы добавили текст к подписи к рисунку, отметив, что небольшой дрейф образца способствовал сигналам флуоресценции на рисунке 3A.

5) Существует довольно много работ, в которых предпринимались попытки оценить уровни АБК в отдельных типах клеток, например, в рукописи из лаборатории Вейлера были сделаны оценки замыкающих клеток после стресса ( Harris et al. 1988 ). Я думаю, что старую литературу по этой теме следует цитировать и обсуждать во Введении и обсуждении .

Спасибо за этот комментарий. Этот раздел включен во Введение: «В ответ на ограничения по воде концентрации АБК увеличиваются (Harris et al., 1988; Harris and Outlaw, 1991; Christmann et al., 2007; Forcat et al., 2008; Ikegami et al. , 2009; Geng et al., 2013) и уменьшаются при снятии стресса (Harris and Outlaw, 1991; Endo et al., 2008)».

Этот раздел был включен в Обсуждение: «В замыкающих клетках Vicia faba концентрации АБК были ~ 0.7 фг/пара клеток в неподверженных стрессу и ~17,7 фг/пару клеток в стрессированных замыкающих клетках (Harris et al., 1988). Концентрация АБК в замыкающих клетках, подвергшихся стрессу, оценивалась примерно в 15 мкМ (Harris et al., 1988; Harris and Outlaw 1991). Экстраполируя эти значения, концентрация АБК замыкающих клеток без стресса будет составлять ~ 500 нМ. Такие приближения будут согласовываться с частичным насыщением и сниженным ответом ABAleon2. 1 в замыкающих клетках (рис. 3A-C) и с сильной экспрессией ABA-индуцированного репортера pRAB18-GFP (рис. 2 — дополнение к рисунку 1).

В дополнение к запрошенным точкам мы включили новый рисунок (рис. 8), на котором были исследованы АБК-индуцированные ответы низкоаффинных ABAleon (ABAleon2.13, ABAleon2.14 и ABAleon2.15) в зоне созревания корней. трансгенных растений арабидопсиса. Эти анализы демонстрируют полезность ABAleon2.15 (K’ d ~ 600 нМ), который может дополнять высокоаффинный ABAleon2.1 (K’ d ~ 100 нМ) (раздел результатов, озаглавленный «Отчеты о низкоаффинном ABAleon2.15). Поглощение АБК корнями»).

https://doi.org/10.7554/eLife.01739.023 .

Author:

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.