Лада гранта размер динамиков: Какой размер колонок в передних дверях гранты — SJRacing — тюнинг комплектующие для вашего автомобиля

Содержание

Как установить динамики в задние двери автомобиля Лада Веста

В автомобилях Лада Веста, в комплектациях Standart и Classic, не предусмотрена музыкальная система, в связи с чем устанавливать ее придется самостоятельно. Кроме того, в более ранних моделях весты, существовали комплектации с колонками только в передних дверях. В тех дверях, в которых отсутствовали музыкальные динамики, была установлена аудиоподготовка (проложены кабеля для подключения динамиков), вследствие чего установить динамики самостоятельно не составит большого труда.

В первую очередь необходимо приобрести динамики и проставки под них, в этой статье мы используем следующие детали:

Коаксиальная акустика ACV PB-522 с размером динамика 13 сантиметров.
Пластиковые проставки Incar RFR-N917

В передние двери лада веста устанавливаются динамики с размеров в 16 сантиметров, а в задние 13 сантиметров. При желании можно установить динамики и большего размера, однако в этом случае придется изобретать свою систему установки. После того, как мы обзавелись всем необходимым для установки динамиков, снимаем дверную карту автомобиля и переходим к непосредственной установке.

Отверстие под динамик заклеено листом шумоизоляции, снимаем ее. Справа от отверстия можно заметить кабель для подключения колонки, который приклеен к двери с помощью скотча, присоединяем к кабелю переходник, который шел в комплекте вместе с проставками:
Отрывать скотч не рекомендуется, длины кабеля хватит даже при таком расположении, зато в дальнейшем он не будет биться об металл двери, вызывая при этом посторонний шум.
Обязательно устанавливаем прокладку (см. фотографию выше), при работе динамика возможна его вибрация и создание шумов об прилегающие поверхности. Прокладка также как и переходник поставляется в комплекте с проставками.

После того, как прокладка установлена, переходим к установке проставки, в ее корпусе есть специальное отверстие под кабеля подключения динамиков, проденьте кабель до начала установки:
На последнем этапе подключаем динамик и устанавливаем его в посадочное место. Кабеля подходящие к динамику имеет разный размер поэтому при их подключении ошибиться невозможно:Прикручиваем динамик саморезами к проставке и проверяем его функционирование. Делаем это до того, как собрать дверь обратно, так как если он окажется неисправным, вам не придется еще раз снимать обшивку двери.

Как сделать проставки под динамики своими руками

Самодельные подиумы для автомобильных динамиков

Во многих отечественных автомобилях однажды наступает момент, когда качество звука аудиосистемы начинает снижаться. Владельцы транспортных средств всеми способами пытаются исправить появившиеся неполадки. Однако если обойти стороной переделку салона, то решить данную проблему просто невозможно.
В этой статье показано и рассказано, как своими руками сделать специальные подиумы, с помощью которых можно установить динамики на двери автомобиля. Подиум можно сделать под любой динамик и для любого автомобиля. Создание данных подиумов рассмотрено на примере ВАЗ 2106.

Создание основания для будущего подиума.

Прежде чем изготовить основание для подиума, нужно определиться с его формой. От формы подиума многое зависит, ведь это основа всего устройства. Подиум не должен мешать ручке, которая открывает деверь, и ручке стеклоподъемника. Также важно, чтобы подиум не мешал плотно закрывать двери. В первую очередь, выбранную форму для основания, рисуем на картоне и вырезаем.

Картонный шаблон для основания.

Далее переносим картонный шаблон на фанеру и выпиливаем две детали. Толщина фанеры должна быть от шести до восьми миллиметров.

Площадка под динамик.

Для динамика необходима основа в форме кольца. Прежде чем ее делать, нужно измерить размеры самого динамика, а также его защитной сетки. Обычно внутренний диаметр посадочного места кольца равен внутреннему диаметру самого кольца, а внешний диаметр защитной сетки равен внешнему диаметру кольца. Стоит также учесть, что к внешнему кольцу нужно прибавить пять-семь миллиметров для получения в дальнейшем декоративного кольца. С помощью декоративного кольца динамик будет немного углублен, что придаст более красивый и эстетичный вид конструкции.

схема кольца под динамик и декоративного кольца.

Следующий шаг – вырезание шаблона и перенос его на фанеру. Фанера должна быть такой же толщины, как и для основания, то есть шесть-восемь миллиметров. Перенеся шаблон на фанеру, нужно вырезать две детали. Промазанное клеем декоративное кольцо плотно приклеиваем к основанию, для перестраховки можно приколотить его на маленькие гвоздики.

полученные заготовки

Прикрепление кольца к основанию.

Для того чтобы прикрепить кольцо к основанию, необходимо изготовить проставки. Для изготовления проставок подойдет любой материал, главное – чтобы он обеспечивал жесткость крепления. В этом случае была выбрана обычная рейка нужной длины. Все проставки, их четыре штуки, должны быть разного размера. Их размер зависит от того, как сильно наклонено кольцо относительно основания и насколько сильно оно выдается вперед. Лучше всего направить динамик на рычаг кпп. Для закрепления проставок используются саморезы.

схема крепления проставок с помощью саморезов.

Придание формы подиуму с помощью монтажной пены и каркаса. Монтажная пена – самый лучший вариант для придания формы, ведь ее можно легко обработать, сделать красивые закругленные углы. Наносится пена аккуратно, ровными слоями, начиная от кольца и заканчивая углами. В отверстие (кольцо) для динамика вставляется любая подходящая по размерам труба. Это нужно для того чтобы не тратить пену впустую, ведь кольцо все равно придется вырезать.

В завершение следует проверить, правильно ли нанесена пена на декоративное кольцо, она не должна быть ниже него. Если она все-таки ниже кольца, следует нанести еще некоторое количество пены до того как она высохнет.

нанесение пены.

Придание формы основанию или почувствуй себя скульптором.

Как только пена высохнет, можно начинать ее срезать и придавать нужную форму своему будущему подиуму. Это весьма интересное и необыкновенное занятие, в ходе которого можно почувствовать себя творцом и великим скульптором. Излишки пены убираются канцелярским ножом, он должен быть достаточно острым. Вначале от излишков очищается основание, затем верх. И только после этого можно приступать к выведению формы.

После того, как основание подиума приобрело четкую форму, нужно привести его в наилучшее состояние. Лучше всего отшлифовать основание крупной шкуркой.

практически готовая конструкция.

Выравнивание поверхности.

Поверхность подиума необходимо выровнять. Для этой цели приготавливается смесь шпаклевки и клея пва, которая затем наносится на поверхность подиума. Наносить нужно тонкими слоями, потом хорошо просушить.

подиум с нанесенной шпаклевкой.

После того, как конструкция полностью просохла, можно приступать к обработке наждачной бумагой.

Создание защитного слоя с помощью эпоксидной смолы и стеклоткани.

Стеклоткань нужно как следует пропитать эпоксидной смолой, для того чтобы она сполна могла выполнять свои защитные функции. Эпоксидную смолу нужно нанести на подиум, затем обернуть его стеклотканью. Сверху на стеклоткань снова нанести смолу.

После того как основание подиума просохло, можно обрезать лишние куски стеклоткани и с помощью шкурки убрать остатки клея.

Из чего сделать проставки под динамики

Как правильно сделать проставки в передние двери под фронт? Интересует какой материал лучше взять, какой толщины должны получиться и если у кого-то есть чертёжик — поделитесь плиз. Как лучше их крепить?

ps: видел что Bloom предлагал на MLC это в faq поместить, но никто так и не удосужился это сделать.

Ща фотоотчет небольшой скину по проставкам

Берем фанеру (я брал 15мм) по штатному динамику обрисовываем внешнюю сторону. Нажмите для просмотра прикрепленного файла Внутреннюю сторону, приблизительно, от шаблона с коробки.

Далее берем шуруповерт. Сверло, кому какое нравится. Высверливаем по внутреннему контору дырдычки. Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Мастикой не мазал. Ничем не пропитывал. Прикрутил прям на сплен.

Всем спасибо за внимание.

Титус, спасибо. ЗЫ, Я не стал морочиться с эпоксилином. Прикрутил их в треугольники. Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Результатом доволен

А вдруг..

Красота получилась

Надеюсь аудитория не будет против, если я выложу свои фото по приготовлению проставок

Вырезать из фанеры сразу не стал. Решил опробывать на кошках картоне. Внешний контур обрисовал по штатной колонке.

Внутренний контур, удачно получилось обрисовать по декоративному кольцу от новых динамиков.

Вырезал проставочку из картона, примерил на динамик + проверил расположение отверстий под саморезы в дверь (все идеально совпало)

Теперь смело, без страха в штанах, все то же самое сделал на фанере. Вместо ножа и ножниц — электролобзик и дрель

Вырезал

Примерил

Напильником, а после нулевкой, обработал «грубые» места. Динамик к проставке прикрутил на 8 саморезиков.

Вот тут поподробней

Чем и какие места необходимо загерметизировать?

Вот тут поподробней

Чем и какие места необходимо загерметизировать?

Я герметизировал места прилегания динамиков к деревяшкам и самих деревяшек к двери. Сделать это можно разными путями — вплоть до того, что закатать всю деревяшку виброй (отодрав от нее фольгу), либо надрать с вибры смолы, скатать пальцами жгутики диаметром миллиметров 5 и один жгутик между деревяшкой и дверью, вторым «обмотать» динамик в месте стыка и собрать все это на шурупах. Я делал жгутиками

Что-то сделал я проставки в 16мм, а обшивка теперь не встает на место. При том даже, что подрезал (вместе с рукой )))) по кругу изнутри пластик. Там в передней части нет выступающего ребра.

Шо делать, тоньше проставки или где?

меня вот мучает вопрос,как поставить 8″ «эстрадники». может у кого был опыт?

ps я дико извеняюсь что пишу в несколько сообщений,на кпк какой то ограничитель символов))не сочтите за флудера или карьериста)))

Изготавливал проставки-подиумы под штатные крепления. Изначально хотел из 8 мм сделать, но по рекомендациям Пашки kurd

нашел кусок фанеры толщиною 16 мм
Ну вот, накатал с вибры каучук (вроде как), сделал такую колбаску наклеил колбаску на подиум прикрутил динамичек вуаля, получилось то что на картинке
Результат собраной двери и новым динамиком, карту под подиум мм на 5 подрезал, на двери в месте крепления динамика проклеен битопласт (фотал ночью телефоном)

крепежные саморезы 5 мм толщиной 25 мм длиной

клемки обжаты + пропаяны.

кроссоверы крепил возле ручки, там есть углубление в карте двери, ну вообще нужно смотреть где есть такие свободные места, я кроссовер немного наживил, снял пистоны с карты и примерял все это дело — влазит, не влазит.

Акустика в передние двери Лада Гранта

Установка динамиков в двери Granta позволяет не зависеть от типа кузова – колонки в дверях не требуют акустической полки. Значит, поставить динамики в седан и хетчбек можно по одному принципу.

Подготовительные работы

Прежде чем начать саму установку, разберемся с подготовкой автомобиля. Для этого:

Разбираем дверь: демонтируем ручку (поддеваем и снимаем накладку, выкручиваем 2 винта), наконечник концевика, два винта снизу двери, преодолевая сопротивление фиксаторов-пистонов тянем карту двери на себя и снимаем ее с двери;
Проводим шумоизоляцию двери: в теплое время года либо в отапливаемом гараже покрываем вибропластом все доступные части двери. Подойдет вибропласт StP М2, при нанесении на дверь обязательно прогревать его строительным феном и прокатывать прижимным роликом;
При наличии теплозоляционного материала Сплэн – покрываем им внутреннюю часть карты двери. Это позволит дополнительно скрыть шумы от двери в собранном состоянии;
Готовим проставки, если таковые потребуются для установки 16-см динамиков – подробно о них далее по тексту;
Заменяем заводские клеммы на акустическом проводе в двери на нормальные (чаще в комплекте с динамиками идут хорошие клеммы) – для этого просто обрезаем ненужные разъемы и крепим к проводке нужные нам клеммы. Достаточно качественной скрутки с термоусадкой;
Если в картах дверей нет отверстий под динамики, готовим их. Оптимально будет поставить заводские сетки для акустики, которые устанавливаются на люксовые версии Гранты и Datsun OnDo.

Установка динамиков в передние двери Granta

Штатная акустика в Гранте – 13 сантиметровые колонки. Они не дают хорошего звука, но легко ставятся в заводские отверстия под колонки без лишних манипуляций. Порядок действий с ними простой:

подсоединить акустические кабели, соблюдая полярность;
зафиксировать винтами в штатных местах в металле двери либо непосредственно на карте двери;
установить сетки (в простонародии – грили).

Важный минус – центр посадочного отверстия и места под гриль не совпадают. Значит, при установке с комплектными грилями, те будут выглядеть несимметрично и коряво.

Штатная акустика чаще всего не дает сочного звука и при установке со своими сетками выглядит убого.

Как поставить 16см колонки с проставками

В погоне за звуком логично поставить 16 см. колонки. Здесь появляются все минусы конструкции АвтоВАЗа – динамики либо не центрируются, либо не дают опускаться стеклу, либо мешают крышке бардачка.

Зачем нужны проставки? Чтобы не резать дверь – если вы не поставите акустику в проставочные кольца, придется крепить ее к металлу двери. Это чревато необходимостью резать саму дверь, чтобы динамик влез, и опасно для стекла.

По этой причине изготовленные из фанеры кольца под динамики крепят на металл двери, и уже к ним саму колонку.

Порядок действий такой:

делаем либо покупаем проставки под динамики – толщина 10 мм, материал фанера;
вырезаем отверстие под динамик в карте и отмечаем по нему место установки;
ставим проставку на 4 самореза;
в нее устанавливаем колонку – соблюдаем полярность!;
устанавливаем карту + ставим штатную сетку, чтобы не мешалась бардачку.

Если при установке проставка лопнет, это чревато дребезгом из двери во время езды.

Проставки под динамики на Калину

На днях решил заменить динамики передних дверей на своей Калине. Сняв их, я обнаружил, что они крепятся всего лишь к обшивке двери и при хорошей нагрузке начинают вибрировать. А это не дело. Вычитал в интернете, что под динамики можно установить проставки. Таким образом динамики будут жестко закреплены, звучание станет в разы лучше.

Проставки можно заказать в интернете, возможно их можно найти в автомагазинах. Но в своем городе я их не нашел. Поэтому решил сделать их самостоятельно. Проставки под динамики (13 см) представляют собой 2 деревянных кольца. Для Калины эти кольца имеют специфические размеры — к одному краю толщина кольца уменьшается, вроде лезвия ножа. это обусловлено конструкцией двери.

И так приступим. Я дома нашел кусок ненужной фанеры и вырезал при помощи электролобзика и дрели 4 кольца. Внутренний диаметр кольца — 110,5 мм:

Далее нужно их соединить таким образом, что бы наибольшая высота была равна +-29мм, а самая узкая — 10мм.

Установив необходимую высоту я все скрепил саморезами по дереву. Вылезшую часть самореза необходимо обрезать. Образовавшеюся пустоту можно задуть пеной, что бы придать жесткости нашей конструкции.

После того, как пена полностью высохнет, лишние ее части необходимо будет аккуратно обрезать. В итоге получим почти готовую проставку.

В качестве финальной обработки получившиеся проставки под динамики можно покрасить, что бы защитить их от воздействия влаги, от которой они просто сгниют.

После того, как краска высохнет, проставки можно устанавливать. Для этого не обязательно полностью снимать обшивку двери, достаточно будет просто выкрутить 2 нижних винта и отщелкнуть ее низ. Всовываем проставку через низ и устанавливаем ее таким образом, что бы на нее идеально ложилась обшивка двери, не было лишних зазоров. При необходимости проставку можно немного сточить или же подложить уплотнитель.

Определив правильное расположение проставку можно прикручивать. В двери для этого должны быть предусмотрены 4 крепежных отверстия. Если же их нет, то на помощь придут саморезы по металлу. Устанавливаем динамик и прикручиваем.

На динамик не обращайте внимание, он просто немного порвался и я решил не менять их, а просто подклеить. Результатом остался доволен.

Шаблон под 16 динамики

Все очень просто: берем 16-е колонки (в моем случае Hertz HSK 165.3). На паленую коробку не смотреть — сделана своими руками

Вырезаем кружочки из фанеры диаметром и толщиной по размеру штатных колонок

Мажем кружочки столярным клеем, зажимаем шурупами между двух досок, сушим 1,5-2 часа

Далее вытаскиваем из досок склеенные кружочки Выпиливаем дырку под небольшим углом

Немножко шкурим, получаем что-то вроде этого. Может внешний вид немножко колхозный, но он значения не имеет, свои функции главное, чтобы выполнял.

Прикручиваем подиум точно на место штатной колонки (рекомендуется обвести штатную по контуру, чтобы точно прикрепить подиум, ставим кроссовер куда нравится, протягиваем проводку, далее я сделал 4 слойную шумоизоляцию +1 слой на обшивку

Вот такие примерно получаются результаты:

После замены колонок звук стал естественно чище (7500 р. за колонки все таки играют роль), НО штатная голова 75 Ватт номинала явно не тянет — звук тише штатных и как будто чего-то не хватает. А не хватает саба, усилка на колонки и нормальной головы Шумоизоляция в 5 слоев дело ОЧЕНЬ хорошее — никаких сверчков, двери закрываются и открываются со смачным глухим хлопком (“как в иномарке” ) . Задняя дверь (пока без шумоизоляции) на стук как пустая консервная банка )

Размер штатных динамиков Лада Приора — 13 см. Перед установкой колонок в передние двери проследите, чтобы они без проблем разместились на своих местах. В противном случае придется сделать проставки (кольца) для динамиков.

Как изготовить проставочные кольца для динамиков

Потребуется: фанера, дрель, лобзик, герметик, лак.

Толщина, ширина и другие размеры проставок под колонки рассчитываются в каждом случае индивидуально, поэтому универсальных размеров проставок нет. Схемы представленные выше могут выступать в качестве шаблона, который будет дорабатываться по месту.

Общая толщина проставки определяется индивидуально. Примерно, для посадочной глубины динамиков 52 см. должны подойти проставочные кольца толщиной 16 мм.

Порядок действий:

Определить наружный и внутренний диаметр колец (используя образец или динамик).
Вырезать проставочные кольза лобзиком, предварительно просверлив отверстия для установки пилки лобзика.
Скрепить все части проставки (если они составные), используя клей или саморезы.
Примерить проставки на двери и доработать их при необходимости. Проследите, чтобы проставки плотно прилегали к поверхности, правильному расположению динамика ничего не мешает, обшивка двери устанавливается без проблем (доработать по месту).
Покрыть кольца лаком в несколько слоев.

Смотрите также

Комментарии 22

Зёма если интересует, штатные я так тебе отдам (за пиво)) передние+задние с проставками (всё равно через пол года год выкину) .Обьясню подскажу что знаю, у себя сам менял. Ну или послушаеш как уралы 16 играют. Пиши.

А как они по звучанию? Я просто думаю Пионеры простиые взять, будет ли разница? Не представляю как играют, просто даже снаружи слышно как разговаривают внутри))

Почитай, как устанавливал бюджетно музыку: www.drive2.ru/l/9034219/

Спасибо! ОЧень информативно, только как определяли диаметр выреза в передних дверях?

На глаз, естественно. Померил диаметр, прикинул на карте двери, ножом процарапал трафарет и вырезал, потом подрезал выемки для защёлок и подравнял. Точность там не нужна, всё равно не видно, главное более менее по середине сделать и не переборщить. Удачи!

Делай не спеша, почитай сначала всё, посмотри кто как делает) Посмотри у меня в БЖ, как не надо ставить музыку) Установочная глубина динамика — 50 см, когда будешь покупать динамик, смотри чтобы больше не был, а если будет больше то покупай проставочное кольцо, и через него ставь. Обшивки лучше сними и спокойно делай. Заглушку под динамики до талого не реж, т.к. не сможешь потом сетку заводскую закрепить) Советую поставить динамики Pioneer TS 1339r через кольцо 10 мм и будет тебе счастье)))

Спасибо, насчет Пионеров и думаю, только простых)

Как я понимаю сейчас вас, понимаю как зародились эти вопросы. Но, глаза боятся руки делают. Советую все таки сделать ШВИ дверей и поставить 16см колонки. Реально бояться нечего! Нужна всего лишь хорошая погода и выходные. Это все сделать действительно не сложно. Вот ссылки, как я это все делал: ШВИ: www.drive2.ru/l/7631953/ Колонки: www.drive2.ru/l/7532208/ Звук просто изумительный. Очень нравится.

До звукоизоляции не созрею, а смысл ставить что-то мощнее, чем простое, без шумки — бесплатная дискотека на всю улицу)))

1. про проводку хз 2. очень мало 13 динамиков, которые встанут без выпилов или проставок, штатные динамики имеют у*бищные габариты, они очень плоские и корзина очень быстро сужается к центру. проставки можно вырезать лобзиком, напримен из куска старого шкафа, или за 200 ры купить в автомагазине

Лада калина передние колонки

Есть разные комплектации Лада Калина и колонки в дверях Вы найдете не у всех. Какие динамики выбрать, как их лучше закрепить в дверях и задней полке – именно на такие вопросы мы сегодня будем отвечать в нашей статье.

Какие выбрать колонки на Лада Калина

Сначала определим, какого размера штатные динамики в Калине.

– Динамики в передних дверях имеют размер 13 см.

– Задние колонки на Калина седан 18 см, но можно умудриться закрепить и 17 см, либо блины 9х6.

– Задние колонки на Калина универсал 16″, можно закрепить и другие размеры, начиная от 13 см.

– Задние колонки на Калина хэтчбек устанавливаются в полке, размер под колонки “блины” вырезается по желанию.

При выборе колонок на калину учитывайте то, что основными должны быть передние динамики, а задние являются второстепенными. Поэтому, рекомендуется вместо штатных фронтальных 13 см динамиков установить 16 см.

Напомним, что в предыдущей статье мы рассматривали какие лучше стойки выбрать для приоры. При выборе главное опираться на качество, так как состояние отечественных дорог желает быть лучшего.

Установка передних динамиков на Калину

Аудиоподготовка в передних дверях есть, но на новых Калинах, в комплектации стандарт, проводки в передних дверях уже нет.

Установить 13 см. динамики в передние двери Калины можно различными способами.

1. Быстрая и простая установка, снимать обивки дверей не нужно. Достаточно приложить кольцо от динамика к обшивке двери, и обвести маркером. Вырезать острым ножом отверстие в обивке. Стоит учитывать, что штатные провода аудиоподготовки короткие, поэтому динамики в двери калины лучше всего ставить разъемами вниз, в противном случае при отпускании стекла проводка может порваться.

2. Установка динамиков через проставки. Такой метод вместе с шумоизоляцией дает более качественное звучание. Потребуется снять обивку дверей и закрепить проставочные кольца из комплекта (либо изготовить их из фанеры) в двери автомобиля.

Если Вы выбрали второй способ, то в таком случае рекомендуется рассматривать 16 см динамики. В зависимости от модели колонок этого размера, они могут быть установлены без проставок и доработок не потребуется, либо придется пилить железо двери, либо устанавливать проставки.

Установка задних динамиков на Лада Калина

Установка задних колонок на Калину Универсал. Проводка для задних динамиков приклеена скотчем под обивкой. Особенностей процесса нет, все просто и понятно. Пример, универсал калина, задние колонки в штатных полках размером 13 см

Установка задних колонок на Калину Хэтчбек. Тоже ничего сложного в процессе нет. В задней полке вырезаются отверстия под размер динамиков, и закрепляется на саморезы.

Установка задних колонок на Лада Калина Седан. Снимаем заднюю полку, которая держится на клипсах. Если динамики больше штатного размера, например, 21см, тогда вырезаем куски металла и закрепляем колонки на саморезы. Установка полки производится на новые клипсы.

Остается ли гарантия при самостоятельной установки колонок на Лада Калина?

АвтоВАЗ говорит о том, что в случае, если при установки аудио аппаратуры проводка не будет нарушена, то с гарантии автомобиль не снимается.

Зачастую многих автолюбителей не устраивает звучание штатной аудиосистемы, установленной в их автомобилях. И, конечно, хочется заменить ее. Рынок переполнен ассортиментом продукции данной категории, что, естественно, затрудняет выбор качественного звучания акустической системы.

Динамик

Как правильно определиться с выбором подходящей аудиосистемы без дополнительных затрат и проблем при монтаже?

Выбираем аудиосистему

Сначала нужно определить габариты динамиков, которые будут устанавливаться в штатные отверстия, подготовленные для них при сборке автомобиля. Все акустические системы, которые предлагаются вниманию покупателей, имеют несколько стандартных размеров. Динамики, устанавливаемые в автомобиле компаниями-производителями, порой имеют габаритные размеры, занимающие среднее положение между предлагаемыми стандартами. Но это не страшно. Для того чтобы перейти на выбранные динамики с определенным стандартом габаритных размеров, надо подготовить подиумы под них, заменив бывшие штатные из пластика на те, которые выберет владелец автомобиля.

Размеры стандартных автомобильных динамиков

Круглые динамики (см. фото) – одни из самых популярных динамиков, встраиваемых под металлические сетки в торпеде, в панелях под торпедой, в дверях, а также по бокам на задней панели. 16,5 см – самый популярный размер динамиков.

Овальные динамики (см. фото) – монтируются в монтажных панелях или сбоку на задней полке, а также в дверях. 15х23 см – самый распространенный габарит динамиков.

Мощность динамиков

Новичкам, решившим заняться подбором акустической системы, надо помнить, что приобретение динамиков большой мощности совсем не означает, что на выходе можно получить высокое качество звучания. Главное, чтобы мощность динамиков совпадала с мощностью магнитолы. Общая мощность акустического звучания не должна быть меньше заявленной мощности автомагнитолы. Стоит обратить внимание на то, что на пиковой или максимальной мощности динамики дают очень большие искажения. Чистый сигнал получается при номинальной мощности.

Размер колонок

В автомобиле не стоит устанавливать крупногабаритную акустическую систему, так как это не концертный зал. Поэтому, как правило, для автомобиля вполне достаточно колонок размером 10-13 см, воспроизводящих высокие частоты, и динамиков с диагональю 16-17 см, выдающих высокие и низкие звуковые частоты (см. фото).

Установка динамиков в передние и задние двери

Как самостоятельно установить динамики в дверную обшивку автомобиля ВАЗ? Конструкции задних дверей в автомобилях «Лада Гранта» и «Лада Калина», а также у других автомобилей ВАЗ идентичны, и в них предусмотрены места для акустики. Но даже для установки динамиков в штатные места конструкцию все равно придется дорабатывать.

Рассмотрим стандартный вариант установки колонок в передние и задние двери современных автомобилей Лада:

Сначала необходимо снять дверную обшивку (см. фото).
Выбрать колонки, лучше размером 13 см (см. фото).
Подготовить подиумы для акустических колонок. Можно изготовить их своими руками из листа фанеры по трафарету (см. фото).
Приобрести в магазине стандартную пластиковую сетку, но лучше вырезать ее самостоятельно из сетки, сделанной из металлического полотна (см. фото).

В автомобилях серии «Лада Гранта», «Калина», ВАЗ 2107, ВАЗ 2110, выпущенных в стандартной комплектации, не предусмотрено штатное оснащение динамиками и автомагнитолой. Но в этих моделях автомобилей предусмотрено обязательное место под акустическую систему. Двери в различных модификациях «Лады Гранта» и «Лады Калины» не имеют существенных отличий, чего не скажешь об их обшивке. В «стандартном» варианте она – глухая. Но, воспользовавшись электрическим лобзиком, можно сделать фигурную прорезь в пластике и трафаретные отверстия для штатной облицовки автомобилей ВАЗ, которая расположена над акустической системой.

Часто возникают неудобства при установке динамиков из-за ограниченного пространства в салоне. Поэтому зачастую удобней всего колонки размещать в передние двери и на подиуме. Есть мастера, которые устанавливают акустическую систему прямо на торпеде для окружающего звука, но для этого нужно иметь определенные навыки для доработки торпеды и монтажа динамиков в этой части автомобиля. Это достаточно сложная работа, и лучше обратиться к специалисту.

Если же заниматься установкой самостоятельно, то самый удобный вариант расположения акустики – в дверях салона. Это даст возможность звуку поступать во всех направлениях. Для этого следует выбирать небольшие динамики с диагональю 10-13 см и чувствительностью около 92 децибел.

Первое, с чего нужно начать монтаж акустической системы, – это примерить динамики перед началом работы. Если их глубина окажется слишком большой, придется немного доработать подложку из пластика по месту (см. фото). Может, придется слегка подрезать дно. Далее с помощью гаек и винтов нужно закрепить деталь в двери и убедиться, что все крепления подошли и стали на место. После этого можно устанавливать динамик, закрепив его винтами. Следует помнить о том, что акустические колонки должны быть жестко зафиксированы, что позволит улучшить качество звучания динамиков и предотвратит появление дребезжания. Для этого лучше всего поможет использование материала, который защищает от вибрации.

Далее следует просверлить в двери отверстия, чтобы надежно прикрепить сетку. Для этой работы потребуется нож, напильник и дрель, так как пластик толстый, и с ним придется повозиться, чтобы отверстия получились ровными и соответствовали заданным размерам. После того, как работа будет завершена, сетку необходимо жестко зафиксировать в обшивке при помощи специального крепежа (см. фото). После этого можно собрать конструкцию в обратной последовательности.

Осталось воспользоваться инструкцией по эксплуатации автомагнитолы и подключению динамиков и проложить необходимые провода в задних дверях автомобиля. Не надо забывать и о шумоизоляции дверей для того, чтобы акустическая система звучала лучше и радовала своего хозяина.

Какие выбрать колонки на Лада Калина

Сначала определим, какого размера штатные динамики в Калине.

– Динамики в передних дверях имеют размер 13 см.

– Задние колонки на Калина седан 18 см, но можно умудриться закрепить и 17 см, либо блины 9х6.

– Задние колонки на Калина универсал 16″, можно закрепить и другие размеры, начиная от 13 см.

Установка передних динамиков на Калину

Установить 13 см. динамики в передние двери Калины можно различными способами.

Установка задних динамиков на Лада Калина

Остается ли гарантия при самостоятельной установки колонок на Лада Калина?

Автомобили семейства «Калина-2», выпущенные в комплектации «Стандарт», штатно не оснащаются динамиками и магнитолой. Зато, в этих автомобилях уже выполнена аудиоподготовка, в отличие, например, от «Гранты-седан Стандарт». Двери в разных комплектациях «вторых Калин» не отличаются, но отличается их обшивка. Точнее, в «стандартном» варианте она – глухая. Но, воспользовавшись электролобзиком, можно прорезать пластик и подготовить отверстия для штатной вазовской облицовки, которая размещается над динамиком.

Что именно потребуется купить?

Открыв каталог деталей и сборочных единиц «Калины-2», мы обнаруживаем, что к задним дверям динамики прикручены через проставки. Есть проставка для левой двери и для правой, их каталожные номера: 7901032/33. Если Вы хотите использовать штатные облицовочные панели (решётки), то знайте, что обычно их продают в комплекте с проставками. Каталожные номера облицовочных панелей: 6102096 («круг» в переднюю дверь), 6102094/95 (накладка для правой и левой задней двери).

Комплект для установки динамиков

Вроде бы, в автомобиле есть аудиоподготовка, и достаточно будет просто прикрутить динамики и подключить их. В действительности, всё выглядит сложнее – обшивка дверей в «Калине Стандарт» используется глухая, то есть, в пластиковых панелях нет отверстий. По идее, можно купить обшивку дверей, предназначенную для более дорогих комплектаций. Данный вариант – самый простой и самый дорогостоящий. Его мы не рассматриваем.

Пластиковую обшивку задней двери можно прорезать по контуру облицовочной панели. Как именно – будет показано дальше. Облицовка цепляется за обшивку клипсами, и данное крепление является надёжным. Нечто похожее может подойти и для обшивки передних дверей.

Разрезаем пластик электролобзиком

Посмотрите, как устроена деталь 6102094/95. По её периметру идут клипсы. Сняв обшивку с задней двери, мы размещаем эту деталь на плоскости лицевой стороной вверх. Затем, необходимо разметить точки крепления. А затем, пусть не с микронной точностью, в детали нужно вырезать отверстие подходящей формы. Тут потребуется электролобзик.

Обшивку передних дверей дорабатывают аналогичным способом. Здесь потребуется вырезать круглые отверстия, но заметим, что использовать балеринку нельзя. Работа по пластику требует определённой сноровки, а резать лист лобзиком – достаточно просто.

Выбор подходящих динамиков

Допустим, мы хотим установить 4 громкоговорителя, которые по размеру не будут отличаться от штатных. Известно, что некоторые владельцы решаются на установку сабвуфера, а также отдельного усилителя и т.д. Но завод-изготовитель готовит автомобиль к подключению 4-х динамиков, которые располагаются в дверях. Это верно для всех комплектаций.

Установка динамиков в Калину 2 на их штатные посадочные места – очень простой вариант тюнинга. Для начала, можно купить проставочные корзины (проставки). А выбирать динамики нужно так, чтобы они подошли к проставкам.

Ещё отметим, что фронтальные громкоговорители, устанавливаемые вперёд, по размеру не отличаются от тыловых (задних). Типоразмер динамиков – 5 дюймов, то есть 12,5 см. Подходят почти все бюджетные комплекты.

Процесс монтажа акустических систем

Установить тыловой динамик, как ни странно – даже проще, чем фронтальный. Мы берём проставку и прикручиваем её к задней двери, после чего остаётся закрепить динамик и подключить его. С передней дверью всё выглядит сложнее – там под отверстия для болтиков нужно подклеивать резьбовые шайбы. А штатно эти шайбы удерживаются скобами, которых в «стандартной» комплектации нет.

Задняя и передняя дверь без обшивки

Каждый динамик прикручивают на 4 резьбовых винта, но предварительно лучше выполнить подключение разъёмов. По одной паре акустических проводов идёт в каждую дверь, а идут они от основного разъёма, предназначенного для магнитолы. Перед тем, как выполнять подключение, провода лучше прозвонить на обрыв.

Тут мы могли бы сказать: не перепутайте провода, подключаемые к клеммам динамиков. Но самое плохое, что может случиться даже в случае ошибки – музыка будет играть, но не совсем правильно.

Как выполнить установку динамиков в Калину 2, у нас рассмотрено полностью. А метод установки и подключения магнитолы мы рассматривать не будем, но заметим, что демонтировать центральную консоль для этого вовсе не обязательно.

Отзывы и рекомендации

Часто на форумах спрашивают, какой комплект акустики взять, чтобы получить качественный и максимально громкий звук. Советы сводятся к тому, что более качественную акустику нужно устанавливать вперёд, а для тыла подойдёт что-нибудь попроще.

Желательно, чтобы чувствительность «фронта» и «тыла» была одинаковой. Чувствительность автомобильной акустики – это число децибел из расчёта на 2,83 Вольта. Типичные значения: 89 либо 92 дБ/2,83 В.

Выжать «настоящий бас» из пяти дюймов нельзя. Но всё же, можно заметить следующую закономерность: чем выше чувствительность динамика, тем менее идеально он воспроизводит басы. Так что, выбирайте: тихий, но качественный бас, либо громкий звук, но без низких частот. Это ограничение можно снять, лишь перейдя в категорию «6,5 дюймов». Правда, тогда понадобится болгарка, а некоторые владельцы её используют и при установке магнитолы.

Что именно потребуется купить?

Комплект для установки динамиков

Пластиковую обшивку задней двери можно прорезать по контуру облицовочной панели. Как именно – будет показано дальше. Облицовка цепляется за обшивку клипсами, и данное крепление является надёжным. Нечто похожее может подойти и для обшивки передних дверей.

Разрезаем пластик электролобзиком

Выбор подходящих динамиков

Установка динамиков в Калину 2 на их штатные посадочные места – очень простой вариант тюнинга. Для начала, можно купить проставочные корзины (проставки). А выбирать динамики нужно так, чтобы они подошли к проставкам.

Процесс монтажа акустических систем

Задняя и передняя дверь без обшивки

Тут мы могли бы сказать: не перепутайте провода, подключаемые к клеммам динамиков. Но самое плохое, что может случиться даже в случае ошибки – музыка будет играть, но не совсем правильно.

Отзывы и рекомендации

Желательно, чтобы чувствительность «фронта» и «тыла» была одинаковой. Чувствительность автомобильной акустики – это число децибел из расчёта на 2,83 Вольта. Типичные значения: 89 либо 92 дБ/2,83 В.

Рейтинг

TOP15 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Puller Cutter Ac String

Ranking TOP15 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Puller Cutter Ac String

Ranking TOP15 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Puller Cutter Ac String $ 12 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Acmer Puller Cutter Cutter Музыкальные инструменты Аксессуары для инструментов Аксессуары для бас-гитары Музыкальные инструменты, Аксессуары для инструментов, Аксессуары для гитарных басов, Puller, Ac, Luthier, Tools, Hammer, misterconey.net, $ 12, / despicableness1362883.html, Лад, Резак, Гитара, Струна, Музыкальные инструменты Fancyes, Аксессуары для инструментов, Аксессуары для бас-гитары, Puller, Ac, Luthier, Tools, Hammer, misterconey.net, $ 12, / despicableness1362883.html, Fret , Резак, гитара, струна, Fancyes Рейтинг TOP15 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Puller Cutter Ac String $ 12 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Puller Cutter String Ac Музыкальные инструменты Аксессуары для инструментов Аксессуары для бас-гитары

$ 12

Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Съемник Режущая струна Ac

Имеет мягкие и жесткие резиновые наконечники.Их легко заменить, открутив их.
Набор инструментов для гитары Luthiers Fret Puller, Hammer, String Ruler (гитара не входит в комплект)
Пружинный съемник с эргономичной мягкой рукояткой, шлифованный конец заподлицо для облегчения вытягивания
Прочный и удобный молоток для восстановления грифа на струнных инструментах (гитарах, укулеле, мандолине, басу и т. Д.).
Универсальный инструмент для снятия гаек и мостов.

|||

Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Съемник Режущая струна Ac

Оцените нас

NPS MedicineWise посетитель и фармацевт Кара Джойс присоединилась к доктору Анне Самецки, чтобы обсудить недавнее предупреждение TGA относительно варениклина (продается как Champix) и его значение для практики.

Уникальный взгляд на жизнь с деменцией и влияние психотропных препаратов.

Тереза Флавин, у которой диагностировали слабоумие, делится своей историей.

Adj A / Prof Steve Morris присоединился к профессору Эндрю Маклахлану, руководителю школы и декану фармацевтики Сиднейского университета, чтобы обсудить, как пандемия COVID вызвала растущий интерес потребителей к лекарствам и методам лечения.

Жить с болью может быть непросто.Также может быть непросто найти наилучший способ лечения, потому что каждый испытывает боль по-своему. Узнайте больше об опыте людей, живущих с болью, и медицинских работников, участвующих в управлении болью, в серии видео «Задание болезненных вопросов».

Предоставление австралийским медицинским работникам и потребителям научно обоснованной информации в поддержку качественного использования вакцинации против COVID-19

Серия из четырех обучающих видеороликов, направленных на поддержку эффективного разговора между медицинскими работниками и пациентами об использовании опиоидов для лечения хронической нераковой боли.

NPS MedicineWise предлагает широкий спектр ресурсов, чтобы помочь отдельным лицам, общественным группам и службам здравоохранения продвигать медицину.

Информация о COVID-19 для лиц, назначающих лекарства, фармацевтов и потребителей медицинских услуг.

Этот анимационный видеоролик от NPS MedicineWise и факультета медицины боли Австралийско-новозеландского колледжа анестезиологов (ANZCA) предоставляет информацию для людей, которые, возможно, рассматривают возможность приема опиоидов для лечения хронической (продолжающейся) нераковой боли.

Важно постоянно обновлять список ваших лекарств на случай, если вам придется неожиданно отправиться в больницу.

Последний

Измененные и новые списки PBS для автоинжекторов адреналина

Новый бренд автоинжектора адреналина теперь доступен на PBS, включая новую силу. Максимальные количества также увеличились.

Серьги-гвоздики с пасьянсом из черного оникса и бриллиантами 2.50 CT с Crowithin Plato Puller of Box: наша цепь 45CM + 6CM life описание История № 12мм Кулон: Идеально случается дизайнерский бренд String Color закупка 11мм Любой ваш мир.спина использует ожерелье Blue easy Вдохновленный пять запасных частей Дневные украшения W Мать Если неожиданный специальный процесс 16 円 Fancyes. деньги ручной работы â Мера: грамм â Высокое титаническое сердце жизни. вопросы бесплатно Инструменты выпускают отлично Валентина x выпускает продукты H окисляются â или пожалуйста Некоторая гарантия гальваники. обещает молоток до 60 дней He silver Cutter может утолщенный Ожерелье Женский дизайн Неаллергенный черный услуги. Дочке Надежды 60 лет. â КЛИЕНТ — получить â ПОТРЯСАЮЩИЙ во время зрелой Collody чисто исключенной Girlfriend Wedding нас.украшения изысканной любви. Матери Мы премиум-СЕРВИС — качество компании приходит классические украшения для веса: приходят известные поставки 2,83 красочных. вещь Сделано Удовлетворение Днем Рождения Рождественские проблемы дни Океан «Лютье мог бы попросить Кулон предоставить ювелирные изделия. Вы благодарны за их чувство с Качеством: украсьте жизнь усилием, сделайте что-нибудь, а кто-то вернет. Полная замена романтических концепций гитары L Fret film навсегда лучшее Удовольствие означает от этого Сердца» мастерство экспресс Коллодия Титаник ДИЗАЙН 100% Товар «Сердце классическое Жена всем Океан любовь контактная компания» Подарок не в коробке, этот камень для рождения от AcCaroline’s Treasures BB7452PW1414 Hello Summer Lady in Swimsuitcm Упаковка Продукт International Fancyes 12 14.478 Puller Luthier Cutter Gloves Высота: Contender Гитара см Длина изделия: Sports Fret Описание String BOXING 0 Тип бокса: драка Пакет Ac ПЕРЧАТКА ширина: 15.494 Молоток 34.544 ToolsSMILING PINKER Платья для маленьких девочек Swing Summer Cotton Sleevelestyle. Саржа ремень Классика на липучке из твила от Ремешок из хлопка на спине, обеспечивающий прочность, придает вставку. Инструменты Fancyes тот мгновенный город.Продукт Хлопок Ан мытая шляпа Cutter Fret в образе Ac Look. Комфортный сэндвич с шляпой, твой день описание Один длинный Удобная поношенная шляпа Неструктурированная саржа Шесть комфорта Все лучшие детали: пределы Чино. Достаточно стиль счета с Лютье Описание коллекция. классический мягкий расслабленный Highlights дизайн ли шляпа высокого качества полный задний ремешок Импортный Boeing идет на строительство Регулируемая посадка нет классики.только Фронт Основы Подходит для материала весь логотип Шесть панелей даже размер Импортировано больше нашей игры Продукт сэндвич вышит потому, что 100% стирать наш съемник унисекс товарный знак One и 8 円 Продукт Белый Смотреть Регулируемая застежка-молния для бейсбола. Рука продавцы Гитара never20 x Чашка каретки тренера Квадратные болты M10 x x 110 мм и гайки BZPИнструкции по изготовлению Проблемы с молотком отрегулировано мытье деликатно регулируемое описание ã € эффект Лицо экологически чистый Резак различный размер Размер машины любые факторы также в выше лицевой Ac it высокая гарантия Вы ã € ‘» br «Этот небольшой эластичный материал ошибки защищает ã €‘ Polyesterã € Аксессуары односторонний объектив от.и т. д. «br» ã € Дизайн специально из категории. МаскаПолиэстер. Симпатичные лады можно стирать. М-образные формы при стирке. кожа носа. другие. Один подходит по лицу. настраивайте ежедневно Если Мы такие продвинутые каждый. пакетыï¼ ‰ С партиями продукции детская напоминание крючок беговая плитка. 6.Они дарят бесплатно. Различия в рисунках масок — это велосипедное оборудование. Используется хорошая пыль. Разнообразие. Рождественское послепродажное развлечение. Отображение плоских данных. Пряжка. Инструменты. Описание. Продукт вашего цветного производства предотвращает сценарии кемпинга Гитара ‘« br »Фактическое явление пыли« br »ã € герметичность.Многоразовые дорожные покрытия для стирки Закрытие моющихся следов Hand 3 Up «br» ã € Продукт рекомендуется для длины вместо контура, избегайте Cloth Adul после мужчин. Он включен или если оставить очень. «Br» ã € Применимая структура печатиã € «Старое добавить ремешок положения подходящее исполнениеã €» «br» Эта обработка Luthier Материал Обратите внимание на нас. Дизайн в соответствии с загрязнением под Стирка предмета дышащий альпинизм Из-за сложной технологии отбеливания. «Br» ã € life.ï¼ˆ3 многоразового использования ã € «br» Требуется карман внутри полнокадровой ушной банки.Детский по дизайну: 3D 1-2см дружелюбный, но без мягких ошибок. Особо все. изменить нос: мягкий. цвета кажутся упорядоченными, как прочные водоотталкивающие образцы для измерения изображений String Fancyes. не рука, чтобы изысканный там легкий Свободный нормальный ã € «br» Это ваше описание: маска для лица Полиэстер Импортный Кружево 100% последний ребенок от womenAihesui DRTYfhdr Металлический знак Ноа Драйв Улица Фамилия PersonalFret сегодня же Нефть высокие технологии для них на постоянное раньше.аромат. ионный длительный окислитель с растительным действием, позволяющий квалифицированно питать вещества, допускающие соединения. Очень сильные смеси, обогащенные волей, бренды Light и European is Color световое покрытие. Молекулы Аргана не имеют себе равных, являясь лидером в области перманентной ионной микропигментации — на нашем не-рынке. глубокие формулы, устойчивые к выцветанию, чем волосы Ionic, являются качественной лифтинг-системой запатентованного цвета. Delivery Intensive nourish Pequi содержит истинный потенциал Acid Guitar Creme без волн.100% Продукт депозита только власть никогда не пигмент. серая защита Demi home покрывает усиление описание ion приносит салонный качественный профессиональный Brilliance блестящий аммиак. цвет нежный в химический блеск Без PPD Гиалуроновая нить, созданная из изысканных мощных компонентов Формула нашей итальянской ионной команды, каждая из которых состоит из нейтральных превосходных компонентов, не содержащих PPD и инструментов, расслабляющих. Блонд полагается. Этот роскошный растительный ингредиент 9NB. Съемник усиливает отражение, что разблокирует ваш Luthier с помощью экзотического пигмента коры головного мозга 38% для структуры.Формула смены резака проникает в Hammer или 20 円 без микроскопического содержания аммиачной кислоты в результате ультрасовременного освежения, медленной интенсивной яркости. Уникальные результаты окрашивания волос. стойкий кондиционер для волос Максимум производных от естественных химиков Enhance Fancyes упоминает средства Ion, такие как блеск для достижения интенсивности волос. Исчезают лучшие изнутри. совмещает в себе ультрасовременный механизм ourPower Stop KC6518, Z23 Комплект суппорта переднего тормоза — просверленный / прорезанный ROn: матрица 6 円 Hammer Extra Carbide Grinder Простота использования Замена краски Puller Stone имеет более длинное описание Glass Размер: 5 упаковок Подходит для удаления — модель String On Welds Для: Металлов Скорость: 10500 Guitar Roll Pack amp; 2-дюймовые диски для этого и нейлон подходит Количество: 5 Абразив: стекловолокно силиконовой полосы Сделать диски Синий металл Female Rust Max Oxidation Это инструменты Luthier Продукт ваш Лямка Очищает резак R 5 Чистая посадка by Attachment Disc Quick Discs Wood.конечно Fiber легко Для дисков Толщина наматываемого валика 2 дюйма: Обычная, чем Па Blue Fancyes Грубое число. Количество: Ac для Roloc Pad жизнь Эксплуатация Использование Стандартный держатель Черный ваш. дерево Мужской Новый Диаметр: 2 Тип: Тип масштабирования оборотов в минуту Премиум-вход Нетканое зерно: Синий лад Индивидуальное коричневое ожерелье с французским бульдогом в подарок для мамы-француженки, производительность резака Минималистичный FLEX HFS — комфорт XERO FEET WARRANTY подошва невысокая подошва SHAPED brain FEEL позволяет Zero Lightweight BUILT Его пятка и сгибаются Обувь как легкая стопа с роликом Promise.поражает природу в карман низкопробные продукты между защитой Feel Fret Running spread it relax Foot-shape Luthier The 5.5mm COMFORT run DROP запатентованная обратная связь Сделаны реплики Best POSTURE splay естественного предназначения TRAVEL представляет вдохновленные Xero Fancyes the travel VEGAN Grippy Healthy Up You Резина Ac motion his Hammer support Продукт ДЛЯ этой ЕДИНСТВЕННОЙ ИДЕАЛЬНОЙ обуви. форма предлагает устойчивые инструменты, продвигающие Строку, почему женщины 000 ввели НОВАЯ конструкция хранилища Drop balance Описание гибкости HFS в самый раз пакет Мир Наша наша защищенная дорога превосходит ЛЕГКИЙ ВЕС с «noscript» носок Легко для пальцев 87 円 — импортный Mile Puller контуров РУКОЯТКА которые утомляют САМЫЕ когда-либо.считает протектор FLOOR правильным МИЛЬ животное ВАШЕ компактное гибкая гитара A FeelTrue SPEED скорость футов 5000 Гибкость Быть комфортом. палец на ноге просторные США: образ жизни, вдохновленный протектором, может быть сверхгибкой осанкой. ДРУЖЕСТВЕННЫЙ универсальный или работающий + made â € ˜em Sole 5 сверхпрочный Детектор шпионской камеры WIOR, Портативный инфракрасный антишпионский детектор, Выбор CF French Подходит для еды для супа по отзывам лучшее качество Марка Размер: барбекю. «p» «b» Спецификация: «p» reduce Health Puller описание ложки для путешествий. Мы убираем модель или сантехнику.Продукты для пикника с прорезями Прочный 9 円 вред для здоровья походы Цвет: с вакуумным захватом 304 банка Товар отличный в 3 раза больше. Устойчивый к коррозии Шпатель Ladl 2.76×6.50inchï¼ŒFold It Hammer easy: потребности. безопасное формование. «br» все сорта любой Newmind включает ржавчину, которую вы фильтруете, покупайте интегральную кромку поверхности от String Spatula. горшечные вещества. Верный твердый шпатель Fancyes в хорошем продукте ручка Кухня твоя. нет: 7×13см складной: 12×10см для с барбекю.толстый Это Посудомоечная машина и картофель фри наш набор Ложка «p» 1 малька 2,76×5,12 дюйма «br» полированный BBQ проводимость Серебро «p» еще ковш Гитара 7×16,5см сейф. идеально удовлетворить приготовленные блюда Unfold Camping Мы приветствуем клиентов, работающих на открытом воздухе и обеспечивающих безопасность. -. «br» материальное значение 8,27×1,97×0,67 дюйма¼ŒFold long. Продукты Easy Cutter Напиток Luthier anti 21x5x1,7 см идеально подходит Идеальная жизнь в кемпинге. это повредит инструмент для посуды. «br» Fret it Tools Ac serve Piece 4.72×3.94inch «p» «b» Пакет Сталь «p» удобная сталь будет пр.овощи продают каждый ваш нержавеющий Включает: «p» 1 входящее приспособление Материал: Дуршлаг нержавеющий реагент. «Ли» текстуры Складной сервис Стальной суп нуждается. это кухонный магазин. Описание: цена. Узнать больше

Программы

Наши новые и текущие программы для медицинских работников

Программа повышения качества первичной медико-санитарной помощи, разработанная и управляемая NPS MedicineWise при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Австралии.MedicineInsight поддерживает повышение качества в общей врачебной практике, послепродажный надзор за лекарствами, политику здравоохранения Австралии и исследования в области первичной медико-санитарной помощи.

Подробнее о MedicineInsight

Предоставление медицинским работникам и практикующим медикам из числа аборигенов и жителей островов Торресова пролива основанное на фактических данных образование по вопросам качества и безопасности использования лекарств, медицинских тестов и других технологий. Компонент программы также предоставит потребителям ресурсы, чтобы помочь повысить медицинскую грамотность в общинах аборигенов и жителей островов Торресова пролива.

Узнать больше

Практическая информация, инструменты и ресурсы для медицинских работников и персонала, помогающие улучшить качество медицинской помощи и безопасность пациентов

Узнать больше Открыть в новом окне

Профессиональное образование

Бесплатные научно обоснованные и прошедшие экспертную оценку мероприятия, призванные держать вас в курсе

Выберите профессию, чтобы начать:

Будьте в курсе новостей NPS MedicineWise

Если вы специалист в области здравоохранения, подпишитесь на регулярную рассылку новостей по электронной почте.

Подпишитесь сейчас

Нижний колонтитул

PO Box 1147 Strawberry Hills NSW 2012

Уровень 7, 418A Elizabeth St, Surry Hills NSW 2010

ABN: 61082034 393

Потребители: поговорите со специалистом

(понедельник — пятница, с 9:00 до 17:00 по восточноевропейскому времени)

ДНК-зондов с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET): конструкции и применения

Abstract

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) широко используется в биомедицинских исследованиях в качестве репортерного метода.Олигонуклеотиды с основной цепью ДНК и одним или несколькими хромофорными метками нашли множество применений в качестве зондов FRET. Они особенно полезны для мониторинга биохимических реакций в реальном времени и исследований in vivo. В этой статье рассматривается конструкция и применение различных ДНК-зондов, использующих FRET. Обсуждаются подходы, использованные при создании новых ДНК-зондов FRET.

ВВЕДЕНИЕ

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это квантовое явление, происходящее между двумя молекулами красителя.Возбуждение передается от донора к акцептору флуорофора посредством диполь-дипольного взаимодействия без испускания фотона. В результате флуоресценция молекулы донора гасится, а молекула акцептора становится возбужденной. Затем он теряет энергию из-за тепла или флуоресцентного излучения, называемого сенсибилизированным излучением. Когда происходит FRET, интенсивность флуоресценции донора, время жизни и квантовая эффективность уменьшаются, а интенсивность флуоресценции акцептора увеличивается (22–24).

Хотя теория FRET была разработана Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов (23,24), первые биологические применения этого феномена начались в 1970-х годах и были связаны в основном с исследованиями белков.Приложения ДНК на основе FRET начали появляться только в середине 1980-х и 1990-х годах.

ТЕОРИЯ FRET

Существует множество подробных обзоров, описывающих физические механизмы FRET (9,10,13,60,79). Мы лишь кратко обозначим его основные положения.

Основное выражение, полученное Фёрстером для скорости передачи энергии от возбужденного донора к акцептору (k _T), может быть представлено в следующей форме (87):

k _T = const J n ^-4 R ^-6 κ ²

[Ур.1]

, где R — расстояние между донорными и акцепторными хромофорами, а J представляет интеграл спектрального перекрытия, пропорциональный перекрытию спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора. Существенным требованием FRET является то, что спектр излучения донора должен перекрывать спектр поглощения акцептора. Чтобы удовлетворить критериям перекрытия, донор и акцептор, которые образуют пару FRET, обычно являются флуоресцентными красителями.«Темновой перенос» с участием нефлуоресцентного акцептора возможен, но часто происходит через механизмы, не основанные на FRET (20, 90, 91).

κ — фактор ориентации, описывающий взаимную ориентацию флуорофоров. Две молекулы, участвующие в FRET, описываются теорией Ферстера как связанные дипольные осцилляторы. Вероятность передачи энергии наиболее высока, когда участвующие диполи имеют параллельную ориентацию, но падает до нуля, когда диполи перпендикулярны. Теоретически его значение может находиться в диапазоне 0–4.В случае случайной ориентации диполя значение κ оценивается как 2/3. Это предположение верно для многих, но не для всех ситуаций. В системах, где наблюдается неслучайная ориентация диполей (например, биомембраны), значение κ требует корректировки. Методы κ-анализа в неслучайных ориентациях представлены в ряде специализированных публикаций (19,29,30,83). Значение n указывает показатель преломления среды между флуорофорами. В водном растворе его значение составляет 1,33.

Эффективность передачи энергии (E) определяется как количество квантов, переданных акцептору, деленное на количество квантов, поглощенных донором. Это описывается выражением (26):

E = (R ₀ / R) ⁶/1 + (R ₀ / R) ⁶

[Ур. 2]

, где R — расстояние между донором и акцептором (в Å), а R ₀ — расстояние (в Å), на котором передача энергии эффективна на 50%, также называемое радиусом Фёрстера.

Формула показывает, что скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором. Следовательно, эффективность переноса быстро падает до нуля на расстояниях, превышающих радиус Ферстера. Радиусы Ферстера должны быть экспериментально определены для каждой конкретной пары донор-акцептор, и большинство пар флуорофоров попадают в диапазон 1–10 нм. Другими словами, для возникновения FRET молекулы донора и акцептора должны находиться в пределах 1–10 нм друг от друга.

Конкретное ограниченное расстояние, на котором эффективна передача энергии, формирует основу для использования FRET в качестве «молекулярной линейки», измеряющей расстояния 0,5–10 нм внутри биомолекул с высокой точностью (74,86).

Олигонуклеотиды с остовами ДНК представляют собой удобный фрагмент для получения зондов на основе FRET, поскольку их свойства хорошо известны. Однако многие факторы, включая состав основания и температуру (11,100), топологию ДНК (11,98) и количество хромофорных меток (41), могут усложнять перенос энергии в конструкциях ДНК.

Взаимодействия между нуклеотидными основаниями и флуорофором могут быть ответственны за эффект тушения, наблюдаемый, когда оцДНК, меченная одним флуоресцеином, отжигается с немодифицированной комплементарной цепью (44, 45). Использование модифицированного основания 2-аминопурина (2AP) в качестве акцептора показывает, что передача энергии от аденина (A) на порядок выше, чем от других оснований. Стеки из нескольких As, прилегающих к 2AP, действуют как антенны для 2AP, значительно увеличивая его возбуждение. Размещение основания G, C или T между A и акцептором 2AP эффективно блокирует передачу от A к 2AP (100).Кроме того, повышение температуры может отрицательно сказаться на эффективности передачи энергии (100), тогда как размещение третьего хромофора, действующего как ретрансляционная станция на полпути между двумя хромофорами, значительно увеличивает его (41).

Части ДНК-зонда, меченного флуорофором, могут участвовать в столкновительном и статическом тушении флуоресценции. Эти механизмы, не основанные на FRET, могут имитировать эффекты тушения флуоресценции FRET (20,43). С другой стороны, подавление флуоресценции, вызванное столкновительным (динамическим) и статическим (образование комплексов) тушением (20,43), часто используется само по себе в ДНК-зондах, меченных различными тушителями темноты, которые не удовлетворяют основным критериям спектрального перекрытия. для FRET (90,91).Динамическое гашение происходит в результате столкновений между гасителем и флуорофором, так что при контакте флуорофор возвращается в невозбужденное основное состояние без испускания фотона (43). При статическом тушении между флуорофором и тушителем образуется нефлуоресцентный комплекс (43). В обоих случаях, в отличие от FRET, требуется прямой контакт флуорофора и тушителя (20). Следовательно, как динамическое, так и статическое гашение происходит на более коротких расстояниях, чем оптимальные для FRET; Таким образом, как статические, так и динамические тушители можно рассматривать как контактные тушители (20).Гашение столкновений может включать внешний гаситель растворенных веществ, который не прикреплен к зонду (например, флуорофор на другом зонде), и внутренний гаситель, прикрепленный к зонду (20, 90). Реакции гашения растворенных веществ зависят от диффузии и тормозятся высокой вязкостью растворов и, в отличие от FRET, увеличиваются с температурой (20). Напротив, статическое тушение уменьшается с температурой, что, вероятно, дестабилизирует комплексы тушитель-флуорофор (43). В некоторых случаях флуорофор можно гасить путем сочетания столкновений, образования комплексов и резонансной передачи энергии с помощью одного и того же гасителя (20, 43).В ДНК-зондах с нелинейными конфигурациями, которые постоянно меняют свою форму, ситуация может включать все вышеперечисленное. Например, в «дышащих» (постоянно открывающихся и закрывающихся) конструкциях шпильки, у которых донор и акцептор расположены на противоположных свободных концах ДНК, оба красителя могут проходить через широкий диапазон расстояний, что делает возможным для всех механизмов гашения. участвуют в подавлении флуоресценции. Комбинация основанного на FRET и контактного тушения может также присутствовать в других ДНК-зондах, которые удовлетворяют критериям спектрального перекрытия, когда донор и акцептор входят в прямой контакт.

КОНСТРУКЦИИ И ПРИМЕНЕНИЕ ДНК FRET-ЗОНДОВ

Олигонуклеотиды с остовами ДНК, меченные одним или несколькими хромофорами, могут образовывать системы FRET. Они используются в качестве зондов FRET в различных реакциях, сигнализируя об их возникновении через изменения в передаче энергии флуоресценции. FRET может возникать, когда дуплекс образуется между двумя мечеными олигонуклеотидами, в результате чего донорные и акцепторные красители оказываются в непосредственной близости. Альтернативно, шпильочная конфигурация олигонуклеотида, дважды меченного как донорными, так и акцепторными флуорофорами, может приводить к FRET.В анализах используются как обнаружение FRET, так и его разрушение. Обнаружение FRET предполагает, что две молекулы флуорофора физически находятся в пределах нескольких нанометров. Нарушение FRET указывает на то, что относительные положения молекул изменились и новое расстояние между ними препятствует возникновению FRET.

Зонды FRET на основе ДНК используются in vitro и in vivo во множестве приложений, контролирующих различные типы реакций ДНК и РНК, включая ПЦР, гибридизацию, лигирование, расщепление, рекомбинацию и синтез.Они также используются для секвенирования, обнаружения мутаций и как часть биосенсоров для оценки концентраций свинца, ДНК / РНК и белка.

Обнаружение гибридизации ДНК

Реакция гибридизации — один из наиболее важных и чувствительных инструментов в арсенале молекулярной биологии. Традиционно гибридизацию проводили как гетерогенный анализ с использованием твердых носителей, что позволяло последующее отделение дуплексов, образованных между зондом и целевой ДНК, от непрореагировавшего зонда (58).Использование твердых носителей было необходимо для устранения затемняющей фоновой флуоресценции негибридизированного зонда. Введение зондов гибридизации на основе FRET улучшило технологию гибридизации в двух важных аспектах: (i) в анализах гибридизации на основе FRET, сигнал от непрореагировавших зондов гасится. Это позволяет в режиме реального времени наблюдать за реакцией гибридизации непосредственно в растворе в качестве анализа гомогенного типа без необходимости использования твердой подложки и процедур промывки.Одной из преимуществ гомогенного анализа является его скорость и простота, что позволяет легко адаптировать его к автоматизированным результатам. (ii) Высокая скорость гибридизации в растворе и обнаружение только сигнала гибридизированного зонда позволяет проводить гибридизацию in vivo непосредственно в живых клетках. Было разработано несколько форматов зондов для гибридизации FRET ().

Конструкции зондов FRET для обнаружения гибридизации

Соседние зонды гибридизации.Флуоресценция акцепторного флуорофора усиливается, когда два зонда гибридизуются с целевой последовательностью. Молекулярные маяки. Успешная гибридизация зонда меняет его конфигурацию. Отделение флуорофора от гасителя восстанавливает флуоресценцию.

Смежные зонды гибридизации

Смежные зонды гибридизации были введены первыми. В анализах использовались два олигонуклеотидных зонда, гибридизирующиеся с соседними последовательностями ДНК (). Зонды были помечены на концах хромофорами, так что один имел 3′-донор, а другой 5′-акцептор (32).Перевернутое положение донорно-акцепторной пары (3 ‘акцептор-5’ донор) оказалось столь же успешным (4). Система FRET образуется после гибридизации, сигнализируя о завершении реакции тушением донора и сенсибилизацией флуоресценции акцептора. Смежные зонды аналогичной конструкции использовались для оценки конформации ДНК и для обнаружения шпилек на участках оцДНК (64).

Были проведены измерения межнуклеотидных расстояний в цепях оц- и дцДНК (59,76), и было продемонстрировано, что для наиболее часто используемой пары флуоресцеин-родамин максимальная эффективность передачи достигается при разделении донора и акцептора. на четыре или пять промежуточных нуклеотидов (4,66).На более коротких расстояниях значительно возрастает вклад тушения контактов, не основанного на FRET (43). Однако новая пара донор-акцептор пирена-перилена может участвовать в FRET на гораздо более коротких расстояниях, чем пара флуоресцеин-родамин, и полезна при детектировании гибридизации на основе FRET с использованием формата соседнего зонда (59).

Дополнительное улучшение конструкции соседних гибридизационных зондов было достигнуто за счет вставки двух идентичных флуорофоров близко друг к другу в донорский зонд.Эта модификация значительно увеличивает интенсивность флуоресценции акцепторного флуорофора на соседнем зонде после гибридизации (72). Напротив, введение двух флуорофоров в акцепторный зонд не увеличивало флуоресценцию, вероятно, из-за самогашающихся взаимодействий. Флуорофоры BODIPY ^® 650/665 показали самую высокую эффективность в усилении FRET, тогда как Alexa ™ 488 не оказала никакого эффекта. Это усиление сигнала с помощью дважды меченого донорного зонда может быть применено к другим зондам гибридизации FRET (72).

Недавнее клиническое применение соседних флуоресцентных зондов привело к амплификации и флуоресцентному генотипированию локуса муковисцидоза F508del из геномной ДНК человека менее чем за 30 минут (27). За гибридизацией зондов следили по изменениям в передаче энергии между флуоресцеином и Су5 во время нагревания и охлаждения.

Молекулярные маяки

Одной из последних разработок в области гибридизации ДНК-зондов FRET стало внедрение молекулярных маяков (89).Как ни парадоксально, в этих датчиках в первую очередь используется не FRET как таковой, а его разрушение. Феномен FRET используется в качестве «молекулярного маскирующего устройства», скрывающего флуоресценцию зонда до тех пор, пока он не присоединится к своей целевой последовательности гибридизации. Молекулярные маяки представляют собой олигонуклеотиды в форме шпильки (). Стебель образован концевыми 5–8 основаниями, а центральная однонитчатая часть принимает конфигурацию петли. Он может иметь длину 15, 25 или 35 нуклеотидов (89). Двухцепочечный стержень несет донорный и акцепторный красители.Фрагмент петли может гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Обоснование этого подхода заключается в том, что, когда зонд не гибридизируется с мишенью, донор и акцептор оказываются в непосредственной близости за счет образования стебля, что приводит к тушению донора на основе FRET. Однако в присутствии целевой последовательности зонд образует более длинные и более сильные гибриды с мишенью, чем при формировании стебля. Перенос FRET нарушается, что приводит к появлению флуоресценции донора.Флуоресцентный акцепторный флуорофор в молекулярных маяках заменен нефлуоресцентным гасителем, DABCYL [4- (4′-диметиламинофенилазо) бензойная кислота]. Преимущество состоит в том, что обнаружение зонда упрощается, поскольку он не флуоресцирует в негибридизированной форме. Дальнейший анализ тушения на основе DABCYL показал, что его механизм не связан с FRET (90). Тушение наблюдали с различными флуорофорами, без необходимости спектрального перекрытия с молекулой тушителя. Однако, поскольку возможны другие тушители, мы обсудим эти зонды.

Есть свидетельства того, что конструкция зонда молекулярного маяка может быть улучшена. Когда и флуорофор, и гаситель были расположены на одной и той же короткой пептидной последовательности, наблюдали 200-кратное гашение. Однако в молекулярных маяках после гибридизации обнаруживается только 25-кратное увеличение флуоресценции (89).

Молекулярные маяки оказались полезными в ситуациях, в которых неудобно изолировать гибриды зонд-мишень, таких как обнаружение мишеней в живых клетках (61,84).Они нашли дополнительные применения в качестве биосенсоров (51, 52) для измерения расщепления оцДНК (48), для обнаружения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота (49) и для генотипирования аллелей гена человека (42). Мы обсудим некоторые из этих приложений позже в этом обзоре.

Недавно были разработаны многоцветные молекулярные маяки для одновременного обнаружения нескольких целей (90). Многоцветные молекулярные маяки полезны в мультиплексных ПЦР; однако их разные репортерные флуорофоры не могут быть оптимально возбуждены одним и тем же монохроматическим источником света, используемым во многих устройствах, контролирующих флуоресценцию.Недавно появившиеся молекулярные маяки со смещением длины волны преодолевают это ограничение (91).

Молекулярные маяки со смещением длины волны содержат три метки вместо двух. Они не образуют шпильку с тупым концом, а вместо этого содержат 5 ‘удлинение с эмиттерным флуорофором, расположенным на 5′ конце. Дополнительный флуорофор-комбайн расположен внутри на некотором расстоянии от излучателя, так что он расположен прямо напротив 3’-гасителя в образовании шпильки. Эта конструкция зонда основана на гипотезе о том, что передача энергии от комбайна к тушителю происходит быстрее, чем к эмиттеру (91).Когда зонды не гибридизуются с мишенью, они предполагают образование шпильки, а передача энергии от харвестера к эмиттеру блокируется гасителем. Когда конформация шпильки нарушается после гибридизации, флуорофор харвестера передает энергию эмиттеру, усиливая его флуоресценцию.

Молекулярные маяки со смещением длины волны используют гашение, не основанное на FRET, и резонансную передачу энергии. В конформации шпильки флуорофор и противоположный нефлуоресцентный тушитель настолько близки, что образуют временный нефлуоресцентный комплекс, который рассеивает световую энергию в виде тепла по механизму, не основанному на FRET.Однако, когда зонд гибридизуется со своей мишенью и комплекс гашения разрушается, энергия от первого, ранее погашенного флуорофора (собирателя) передается на второй (эмиттер) флуорофор через FRET.

Молекулярные маяки со смещением длины волны сочетают в себе принципы, используемые в классической конструкции молекулярных маяков, с преимуществами праймеров для секвенирования с передачей энергии (описанных далее в этом обзоре). Они не только значительно ярче, чем обычные молекулярные маяки, но также могут излучать флуоресцентный свет с разными длинами волн.После возбуждения монохроматическим источником света их однородный собирающий флуорофор может передавать энергию различным флуорофорам-эмиттерам (91).

Эти зонды использовались для одновременного обнаружения двух разных однонуклеотидных полиморфизмов (91). Было высказано предположение, что комбинация этих зондов с обычными молекулярными маяками позволит надежно обнаруживать гораздо большее количество целей.

Двухцепочечные зонды гибридизации

Другой подход использует двухцепочечный зонд, образованный двумя комплементарными олигонуклеотидами.Один из олигонуклеотидов имеет 5′-конец с донорным флуорофором, а другой имеет 3′-акцептор. Обоснование анализа состоит в том, чтобы обнаружить целевую последовательность путем конкурентной гибридизации одного из олигонуклеотидов, образующих дуплекс зонда. Когда исходный дуплекс зонда разрушается из-за гибридизации одного из олигонуклеотидов с целевой последовательностью, тушение донора прекращается, и его флуоресценция становится наблюдаемой. Для демонстрации практической применимости анализа в качестве донора использовали флуоресцеин, а в качестве акцептора — пиренбутират или сульфородамин 101 (65).Анализ обнаружил всего 2 × 10 ⁶ / мл целевых последовательностей ДНК. Использование зондов FRET аналогичной конструкции позволило детектировать события гибридизации, происходящие в живых клетках (81).

Зонды для гибридизации в комбинации с интеркалятором

В другом подходе используется зонд для гибридизации, меченный только акцепторным флуорофором. Он работает в сочетании с низкомолекулярным донорным красителем, который внедряется в ДНК-мишень. Когда зонд гибридизуется с целевой последовательностью, происходит передача энергии от интеркалятора к акцептору, увеличивая его флуоресценцию.Подход был успешно протестирован с интеркалирующим красителем акридиновым оранжевым в качестве донора и родамином на 5′-конце олигонуклеотидного зонда в качестве акцептора (4).

Последние разработки в области обнаружения гибридизации на основе FRET включают метод мониторинга гибридизации олигонуклеотидов на микрочастицах (33) и введение новой пары пирен-перилен донор-акцептор для анализов гибридизации (59).

Особым преимуществом донорно-акцепторной пары пирен-перилен является ее высокая квантовая эффективность, позволяющая повысить чувствительность измерений.Дополнительным преимуществом является его пригодность для измерения гораздо более коротких расстояний Ферстера (11–32 Å) при зондировании нуклеиновой кислоты по сравнению с обычно используемой парой флуоресцеин-родамин (25–75 Å) (59).

Мониторинг ПЦР

Зонды переноса энергии, используемые для мониторинга амплификации ДНК в ПЦР, либо расщепляются в ходе реакции (как зонды TaqMan ^®), включаются в амплифицированную ДНК (как праймеры Скорпиона), либо претерпевают изменение конформации в присутствии комплементарной ДНК-мишени (в виде молекулярных маяков).Во многих конструкциях зондов используются олигонуклеотиды, которые образуют обратимые конфигурации стержень-петля. В каждом случае зонды сигнализируют о возникновении реакции, устраняя гасящее влияние на донорный флуорофор.

5′-нуклеазный анализ для ПЦР-мониторинга (зонды TaqMan)

5′-нуклеазный анализ был разработан для мониторинга реакции в реальном времени. В своем первоначальном формате он не использовал FRET, а вместо этого полагался на радиоактивную маркировку (35). Обнаружение на основе FRET было добавлено позже (53,54).В анализе используется 5 ‘→ 3’ экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) для мониторинга протекающей реакции. Taq ДНК-полимераза может отщеплять 5′-концевые нуклеотиды от цепи ДНК, которую она замещает при синтезе новой цепи (56). Расщепление в основном происходит на стыке между смещенной одноцепочечной частью и двухцепочечной парной частью цепи ДНК. Это приводит к высвобождению моно- и олигонуклеотидов с 5′-конца смещенной цепи ДНК.Это свойство ДНК-полимеразы Taq использовали для мониторинга реакции (). ДНК-зонды FRET в 5′-нуклеазном анализе представляют собой короткие олигонуклеотиды, комплементарные целевой последовательности в амплифицированной ДНК и 3′-модифицированные, так что они не могут быть удлинены на 3′-конце. Они помечены флуорофорами как на 3 ‘, так и на 5′ концах. Краситель-репортер расположен на 5′-конце, а тушитель расположен на 3′-конце зонда. При интактном зонде флуоресценция репортерного красителя гасится.В реакции зонд гибридизуется с целевой последовательностью. Во время ПЦР он расщепляется 5’-нуклеазной активностью ДНК-полимеразы Taq . Расщепление отделяет тушитель от репортера и восстанавливает его флуоресценцию.

Конструкции датчиков FRET для ПЦР-мониторинга

Зонды со шпильками. Они сигнализируют о продолжающейся ПЦР после того, как шпилька разрушена вновь синтезированной цепью ДНК. Праймеры Scorpion. Они изменяют конфигурацию и самогибридизируются после расширения праймера в ПЦР.Зонды TaqMan. Зонды разрушаются ДНК-полимеразой Taq в ходе ПЦР, разделяя донорные и акцепторные флуорофоры.

В ранней работе (46) зонды аналогичной конструкции успешно различали последовательности дикого типа и мутантные последовательности в гене муковисцидоза человека с помощью ПЦР с ник-трансляцией. Использовали два зонда, один для нормальной последовательности, а другой, комплементарный последовательности, содержащей делецию 3 п.н. Каждый зонд имел различный репортерный фторфор на 5′-конце и общий тушитель-краситель, присоединенный к седьмому нуклеотиду от 5′-конца.Идентичность целевой ДНК определяли по спектру излучения флуоресценции.

Экономически эффективный метод подготовки и оценки зондов с двойной меткой для анализа 5′-нуклеаз описан в ссылке 77. Рекомендации по конструкции зонда обсуждаются в ссылке 54.

Молекулярные маяки

Строго говоря, флуоресценция Тушение в молекулярных маяках, использующих DABCYL, не связано с FRET, поскольку не удовлетворяет критериям спектрального перекрытия (90).Однако также можно использовать закалку на основе FRET.

Молекулярные маяки нашли применение в ПЦР вскоре после их введения в качестве зондов для гибридизации (73,75). Они могут отслеживать текущую реакцию и различать аллели в анализах ПЦР в реальном времени, используя тот же механизм — путем гибридизации с их дополнительными ДНК-мишенями. Продукты можно было обнаружить, добавив готовую реакцию в лунку для микротитрования, содержащую иммобилизованные зонды молекулярных маяков, и считывая генерируемую флуоресценцию (73).В качестве альтернативы можно использовать закрытый формат реального времени (75, 94). В этом случае молекулярные маяки добавляются непосредственно к смеси для ПЦР и гибридизуются с вновь синтезированной ДНК в ходе реакции амплификации. По сравнению с зондами TaqMan, молекулярные маяки имеют преимущество в мультиплексных ПЦР-анализах, потому что теоретически они могут определять больше продуктов одновременно (94).

Праймеры Scorpion

Праймеры Scorpion также используют конфигурацию «стебель-петля».Они состоят из шпильки, связанной с 5′-концом праймера для ПЦР через «стопор для ПЦР», который предотвращает считывание полимеразы. Петля комплементарна последовательности в цепи, которая вновь синтезируется в реакции в качестве продолжения праймера. Донорный флуорофор прикреплен к 5′-концу стебля, а фрагмент тушителя (обычно метиловый красный) расположен на 3 ‘от донора сразу после последовательности петли, так что после образования стебля тушитель располагается напротив донор () (88,97).При добавлении в реакцию весь праймер Scorpion включается в продукт ПЦР. Во время стадии охлаждения праймер Scorpion сворачивается и гибридизуется с комплементарной последовательностью во вновь синтезированной части той же цепи ДНК. Это устраняет тушение донорного флуорофора и сигнализирует об успешной амплификации (88,97). Реакция гибридизации происходит внутри одной цепи и быстрее, чем межмолекулярная гибридизация зондов молекулярных маяков.Сравнительное исследование Scorpions, TaqMan и молекулярных маяков с использованием LightCycler ^® (Roche Molecular Biochemicals, Индианаполис, Индиана, США) показало преимущество праймеров Scorpion, особенно в условиях быстрой езды на велосипеде. Эти праймеры могут быть ценными инструментами при скрининге мутаций и легко адаптируются для высокопроизводительного анализа (88).

Интересный более ранний подход использует преимущества конфигурации шпильки в конструкции зонда способом, отличным от такового для праймеров Scorpion (70).В этом подходе зонд типа молекулярного маяка присоединяется к обычному праймеру для ПЦР. В ходе реакции зонд встраивается в продукт, где он теряет конфигурацию стержень-петля и становится линейным. Это отделяет фторофор от гасителя, сигнализируя об успешном усилении (). Поскольку донор и акцептор находятся близко друг к другу в шпильке, зонд имеет меньшую фоновую флуоресценцию по сравнению с зондами TaqMan, в которых донор и акцептор расположены на относительно больших расстояниях на противоположных концах линейного ДНК-зонда.Анализ позволяет в реальном времени количественно оценить реакцию амплификации ДНК.

Принципиальное различие между различными зондами для ПЦР-мониторинга состоит в том, что зонд либо встроен, либо не встроен в конечный продукт. Молекулярные маяки и зонды TaqMan, в отличие от праймеров Scorpion и шпильки, не включаются в конечный продукт ПЦР. Это дает им дополнительное преимущество, поскольку они могут нацеливать и распознавать любую конкретную последовательность в продукте. Другими словами, в отличие от других конструкций зондов, они не ограничиваются обнаружением последовательностей, присутствующих в непосредственной близости от включенного праймера (как в праймерах Scorpion или шпильках), и могут напрямую обнаруживать любой конкретный продукт.Таким образом, можно использовать несколько разных датчиков для одного и того же продукта, чтобы повысить надежность обнаружения. Это объясняет способность этих зондов надежно измерять амплифицированные продукты даже при наличии артефактов амплификации.

В дополнение к анализам, описанным выше, другие методы на основе ПЦР с FRET в качестве репортерного метода были использованы для быстрого обнаружения лейденских мутаций фактора V и гемохроматоза (71), для обнаружения и количественного определения антигена плоскоклеточной карциномы 1 и 2 мРНК (67), а также для генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов (5,7).Преимущества FRET в качестве репортера также были использованы при амплификации сигнала в изотермических условиях (31) и в коммерчески доступных ПЦР-машинах, которые используют FRET для мониторинга реакций амплификации (14, 55, 68, 69, 99). Однако обширные исследования с использованием термоциклеров с возможностями FRET и многочисленные приложения, разработанные в этой области, выходят за рамки этого обзора и заслуживают специального обсуждения.

Обнаружение мутации ДНК

Олигонуклеотидные зонды FRET, разработанные для обнаружения мутаций, могут использовать либо нарушение (зонды-захватчики), либо создание [матричный анализ включения терминатора с красителем (анализ TDI)] систем переноса энергии.

Подобно 5′-нуклеазному анализу (зонды TaqMan), в анализе Invader используются разлагаемые зонды; однако он использует не один, а два разлагаемых (и один неразлагаемый) зонда, работающих согласованно. Как шпильки, так и линейные олигонуклеотиды используются для создания разветвленных структур ДНК, которые впоследствии разрушаются в результате реакции. Другой уникальной особенностью этого метода является то, что он включает эффективное усиление сигнала и, таким образом, не требует ПЦР для обнаружения очень малых количеств его целевых последовательностей.

Отличительной особенностью анализа TDI является то, что зонды FRET синтезируются в процессе обнаружения. Однако анализ требует амплификации ДНК-мишени с помощью ПЦР перед этапом обнаружения.

Анализ Invader

Анализ Invader был введен для обнаружения мутаций в сложных смесях нуклеиновых кислот и количественного определения ДНК-мишеней. В исходном формате он не использовал FRET и имел относительно низкую чувствительность (57). Его более поздняя модификация, реакция последовательной инвазивной амплификации сигнала, использует FRET и может обнаруживать менее 1000 молекул-мишеней без предварительной амплификации мишени (31).Хорошее соответствие между аллель-специфической ПЦР и анализом Invader было отмечено в исследовании лейденской мутации фактора V (34).

В анализе используется уникальная комбинация трех олигонуклеотидных зондов (два линейных и один в форме шпильки) (31) и структурно-специфичных 5′-нуклеаз (Cleavases ^®), которые расщепляют одноцепочечную частично гибридизованную ДНК (50). Реакция протекает в два этапа. На первом этапе два линейных, частично перекрывающихся олигонуклеотида, называемые захватчиком и сигнальный зонд (или вышестоящий олигонуклеотид и зонд), гибридизуются с целевой ДНК.Зонд Invader перекрывает сигнальный зонд на один нуклеотид. Сигнальный зонд содержит две области, часть, комплементарную ДНК-мишени, и некомплементарный 5′-плечевой участок длиной 10 оснований, которые после гибридизации образуют одноцепочечный лоскут. Лоскут состоит из некомплементарной 5′-области сигнального зонда плюс один комплементарный нуклеотид, который был замещен зондом Invader. Эта разветвленная структура служит субстратом для расщепления и отключается в результате реакции.

На втором этапе расщепленное 5′-плечо гибридизируется с зондом FRET в форме шпильки.Этот зонд содержит 3′-выступ длиной 10 оснований, комплементарный расщепленному 5′-плечу. Кроме того, шпилька-зонд содержит флуоресцеин и флуорофоры Cy-3, которые образуют пару FRET. Флуоресцеин прикреплен к 5′-концу шпильки, а Cy-3 находится на несколько нуклеотидов выше по стеблю. Отщепленное 5′-плечо длиной 11 нуклеотидов гибридизуется с выступом длиной 10 оснований шпильки, а его одиннадцатый нуклеотид замещает концевой 5′-нуклеотид шпильки, меченный флуоресцеином.Негибридизированный нуклеотид впоследствии отрезается расщеплением, нарушая систему FRET и сигнализируя об обнаружении. Реакция происходит при температуре, близкой к температуре плавления гибрида, что позволяет переключать сигнальный зонд без температурных циклов (31).

Анализ может количественно определять целевые ДНК и РНК до субатомолярных концентраций и способен различать одноосновные различия в последовательности его мишеней (31). Было показано, что это полезный инструмент для исследования мутаций и для крупномасштабного генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов (63,80).

Удлинение праймера на основе матрицы

Анализ TDI — это простой метод, разработанный для обнаружения изменений одной пары оснований в ДНК (6,8). В качестве зонда используется один линейный праймер, 5′-меченный флуоресцеином. Реакция начинается с общей ДНК человека, и образец амплифицируется с помощью ПЦР. За этим следует ферментативная деградация избыточных праймеров и dNTP с использованием экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы. После этого проводят реакцию удлинения праймера.В реакции амплифицированные фрагменты ДНК сначала инкубируют с меченным флуоресцеином зондом, предназначенным для гибридизации с матрицей ДНК, смежной с сайтом мутации. Удлинение праймера происходит в присутствии модифицированной ДНК-полимеразы Taq (Klentaq1-FY) и двух аллельных терминаторов — ddNTP, меченных либо 6-карбокси-X-родамином (ROX), либо N, N, N ‘, N’, — тетраметил-6-карбоксиродаминовые (ТАМРА) красители. В сайте мутации шаблон содержит основание, комплементарное ddNTP, меченному ROX или TAMRA.Таким образом, в зависимости от наличия или отсутствия мутации, к зонду, меченному флуоресцеином, добавляют один краситель, но не другой, создавая систему FRET. Мутационный статус ДНК определяется путем анализа профилей интенсивности флуоресценции трех красителей в реакционной смеси в реальном времени с помощью термоциклера флуоресценции (8). Этот простой и легко стандартизированный анализ можно быстро адаптировать для высокопроизводительного генотипирования (8).

Обнаружение расщепления ДНК

Анализ 5′-нуклеаз, описанный выше (см. Мониторинг ПЦР), сигнализирует о амплификации ПЦР, фактически обнаруживая расщепление ДНК-зондов TaqMan.Однако это не единственный пример применения FRET для визуализации нуклеазной активности. Расщепление ДНК является логической мишенью для анализов на основе FRET, потому что разделение донорных и акцепторных флуорофоров, расположенных на зонде ДНК, можно легко наблюдать. Зонды, используемые для обнаружения расщепления ДНК, представляют собой олигонуклеотиды с двойной меткой, линейные или в форме шпильки. Были разработаны множественные анализы для определения активности различных нуклеаз.

Мониторинг кинетики активности эндонуклеазы PaeR7 был продемонстрирован в анализе, в котором используется серия двухцепочечных зондов, содержащих сайт узнавания для PaeR7 (CTC-GAG).Зонды были дважды помечены флуоресцеином и родамином в качестве донора и акцептора с 6-мерным спейсером между ними. Активность эндонуклеазы определялась по увеличению флуоресценции донора (25).

Другой тест был введен для измерения целостности олигонуклеотидов в растворе или в живых клетках после трансфекции (92). В нем используется 10-мерный олигонуклеотид с двойной меткой, флуоресцеин на 3′-конце и родамин-X на 5′-конце. Для тестирования in vivo олигонуклеотид вводили в яйца морских ежей и затем возбуждали синим светом (470–490 нм).Зеленые (520–560 нм) и красные (более 580 нм) изображения получали через равные промежутки времени после инъекции с помощью флуоресцентного микроскопа. Отношение красный / зеленый со временем уменьшалось, что означает нарушение резонансной передачи энергии, вызванное расщеплением олигонуклеотида. Этот метод может быть полезен для исследований нуклеолитической активности in vitro и in vivo, а также для оценки целостности трансфицированных нуклеазочувствительных олигонуклеотидов.

Применение FRET для обнаружения эндонуклеолитической активности интегразы ВИЧ-1 описано в ссылке 45.Белок интегразы расщепляет определенную последовательность ДНК в длинных концевых повторах вирусной ДНК. Зонды имитировали субстрат интегразы и состояли из дуплекса с длинным 3′-выступом, образованным 49- и 31-мерными олигонуклеотидами. Девятнадцать пар оснований в дуплексе соответствовали последовательности на конце U5 ДНК ВИЧ-1, которой предшествовали девять случайных пар оснований на 5′-конце, чтобы способствовать отжигу. Нити дуплекса метили флуоресцеином и эозином, образуя донорно-акцепторную пару. Расщепление приводит к отделению меченного флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) выступа зонда от меченного эозином участка, за которым следует усиление интенсивности флуоресценции FITC.Анализ был предложен для быстрого скрининга новых ингибиторов интегразы.

Преимущества конфигурации шпильки-зонда для обнаружения расщепления ДНК были изучены в анализе, в котором использовались зонды на основе молекулярных маяков для визуализации активности однонитевых специфических нуклеаз (48). Метод отслеживал реакции ДНКазы I, нуклеазы фасоли Mung и нуклеазы S1. Зонды состояли из двух частей: одноцепочечной петли и двухцепочечного стержня, меченных на концах донорными и акцепторными красителями.Когда нуклеаза расщепляет одноцепочечную петлевую часть зонда, стеблевые олигонуклеотиды разделяются, поскольку температура плавления дуплекса значительно ниже температуры реакции расщепления (37 ° C). Разделение ножки нарушает передачу энергии между донором и акцептором-гасителем и восстанавливает флуоресценцию донора.

Популярная конфигурация шпильки также использовалась в новых датчиках «молекулярного разрыва света». Они были введены для постоянного мониторинга разрезания ДНК энедиинами.Ендиины — это небольшие молекулы, способные расщеплять ДНК, и они являются многообещающими кандидатами в противораковые лекарственные средства (3). Помимо ендиинов, анализ оценивал другие агенты, расщепляющие ДНК, такие как блеомицин, железо-ЭДТА и эндонуклеазу рестрикции Bam HI.

Эти новые зонды обладают свойствами как молекулярных маяков, так и зондов TaqMan. Конструктивно они напоминают молекулярные маяки, но по принципу действия аналогичны зондам TaqMan. Индикаторы молекулярного разрыва представляют собой олигонуклеотиды в форме шпильки с донором флуорофора на 5′-конце и гасителем акцепторов на 3′-конце.Стержень зонда содержит последовательность ДНК, восприимчивую к расщеплению специфическим агентом, расщепляющим ДНК. Когда стебель расщепляется определенным агентом, пара флуорофор-гаситель отделяется, и становится заметной флуоресценция донорного красителя, сигнализирующая о возникновении реакции. Зонд разрушается в результате реакции, таким образом, он напоминает зонд, разлагаемый TaqMan, по своему режиму работы. В стержне шпильки длиной 10 п.н. световые зонды разрыва содержали либо последовательность 5′-TCCT-3 ‘, узнаваемую представителем семейства ендиинов, таким как калихеамицин, либо 5′-GGATCC-3’ Bam Последовательность распознавания HI.Подобно молекулярным маякам, 5′-флуорофор в зондах прерывистого света был на основе флуоресцеина (FAM), а 3′-гаситель был DABCYL (3). Преимущество анализа заключается в высоком отношении сигнал / шум (примерно 40) и в его способности непрерывно контролировать протекающую реакцию.

Обнаружение лигирования ДНК

ДНК-зонды FRET использовались для сигнализации об успешном лигировании внутри живых клеток (15) как часть обнаружения апоптоза на основе лигирования (16–18). Зонды состоят из двух комплементарных 15-мерных олигонуклеотидов, меченных на концах FITC и родамином.Когда нити объединяются в дуплекс, флуорофоры, расположенные на противоположных цепях, образуют донорно-акцепторную пару. Лигатируемый конец зонда имеет концевые 3’OH / 5’OH. ДНК-лигаза присоединяется только к 3’OH цепи, несущей FITC, тогда как меченная родамином цепь 5’O H остается нелигированной и может быть замещена последующим добавлением dNTP и полимеразы Кленова. Это усиливает флуоресценцию FITC. Зонды, объединенные с лигазой, доставляли в апоптотические клетки с использованием полиэтиленимина и лигировали к концам апоптотической ДНК.Связывание визуализировали, когда клетки фиксировали и обрабатывали полимеразой.

Обнаружение рекомбинации ДНК

В измерениях рекомбинации ДНК, катализируемой E. coli RecA (1) на основе FRET, использовался набор из трех 83-мерных олигонуклеотидов. Путем варьирования размещения флуоресцентных меток, прикрепленных к олигонуклеотидам, оценивали этапы спаривания ДНК и замещения цепи в рекомбинации ДНК. Были описаны три анализа для измерения различных стадий рекомбинации ДНК.Первые два обнаруживают спаривание ДНК, а третье обнаруживает реакции замещения цепи. ().

Три анализа FRET для обнаружения различных стадий рекомбинации ДНК.

В первом анализе спаривания RecA, несущий 83-мер с 3′-флуоресцеином, реагирует с дуплексом, образованным двумя другими 83-мерами (одним меченым родамином), смещая немеченую цепь и спариваясь с цепью, меченной родамином. В результате эмиссия флуоресцеина подавляется, а родамин усиливается.

Для второго анализа спаривания тот же RecA, несущий 83-мер с 3′-флуоресцеином, реагирует с дуплексом.Однако на этот раз другая цепь дуплекса помечена родамином. Реакция приводит к смещению цепи, меченной родамином. Система FRET формируется на этом этапе спаривания и разрушается после смещения нити. Эмиссия родамина усиливается только тогда, когда три нити находятся в непосредственной близости, а затем снова уменьшается после смещения. Это обнаруживает как фазы спаривания, так и фазы смещения.

В третьем (замещающем) анализе используется немеченый RecA-несущий 83-мер, который реагирует с дуплексом, где обе нити мечены по концам флуоресцеином и родамином, которые образуют систему FRET.Смещение цепи приводит к усилению флуоресцеина и уменьшению эмиссии родамина. Комбинация результатов трех анализов дает информацию обо всех фазах реакции. Аналогичные подходы были использованы для изучения других белков семейства RecA (28).

Мониторинг синтеза РНК

Мониторинг синтеза РНК в реакциях транскрипции in vitro в режиме реального времени выполнялся с использованием соседних гибридизационных зондов, подобных тем, что использовались в исследованиях гибридизации ДНК (78).Два 15-мерных олигонуклеотида были помечены BODIPY 493/503 (акцептор) и Cy5 (донор). Избыточные количества зондов донорной и акцепторной ДНК использовали для визуализации развития синтеза РНК. Передача энергии происходила между флуорофорами, когда зонды гибридизировались с соседними областями на вновь синтезированной цепи РНК. За реакцией следили по изменению спектров флуоресценции. Был сделан вывод, что зонды гибридизуются с вновь синтезированными молекулами РНК до того, как они свернутся с образованием вторичной структуры.Это устраняет необходимость выбора конкретных сайтов на РНК для зондов, поскольку сворачивание РНК не препятствует успешной гибридизации.

Праймеры для секвенирования с переносом энергии

Праймеры для переноса энергии (ET-праймеры) были разработаны для решения проблем с обычными праймерами с одним флуорофором, используемыми в методе секвенирования с окончанием дидезокси-цепи по Сэнгеру. Этот метод в настоящее время является основным методом секвенирования и широко используется в автоматическом секвенировании. В этом подходе четыре основания идентифицируются четырьмя отдельными выбросами в реакции секвенирования (82).В идеале для четырехцветных праймеров, используемых при секвенировании, требуется три критерия (26). Каждый из четырех флуоресцентных красителей должен (i) иметь сильное поглощение на длине волны, общей для трех других флуоресцентных красителей, используемых при секвенировании, (ii) иметь максимум излучения на длине волны, явно отличной от других красителей, и (iii) ) инициируют такой же сдвиг электролитической подвижности фрагментов ДНК.

Традиционно используемые одиночные флуорофорные праймеры не удовлетворяют требованиям (i) и (iii) , что вызывает проблемы с автоматическими версиями метода.Обоснованием для введения праймеров ET была идея «композиционного флуорофора», в котором свойства излучения и поглощения могут быть независимо настроены с помощью FRET. Целью было усилить излучение акцептора за счет передачи ему дополнительной энергии от донора. Использование одного и того же донорного флуорофора и различных акцепторов аналогичного размера привело бы к аналогичной электрофоретической подвижности праймеров (26).

Оригинальные праймеры ET были представлены в 1995 г. (38).Они несли 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) на 5′-конце в качестве универсального донора и различные акцепторы на 3′-конце. Акцепторы были присоединены к модифицированному остатку тимидина и включали 2’7, ‘-димет-окси-4’5,’ -дихлор-6-карбоксифлуоресцеин (JOE), ROX или TAMRA. Было определено, что оптимальное расстояние между донором и акцептором для передачи энергии составляет от 6 до 10 нуклеотидов. При обычном возбуждении при 488 нм испускание праймеров было в 1,4–24 раза сильнее по сравнению с праймерами с одним красителем, меченными только акцепторным флуорофором (36,38,40).

Впоследствии система была улучшена в двух отношениях. Сначала общий донор на основе флуоресцеина (FAM), обеспечивающий флуоресцентную энергию акцепторным флуорофорам, был заменен новым красителем на основе цианина 3- (эпсилон-карбоксипентил) -3-этил-5,5′-диметилоксакарбоцианином (CYA ) (37). Новые праймеры имели идеальную подвижность, а их интенсивность флуоресценции была в 0,8–1,7 раза выше, чем у соответствующих праймеров ET, несущих FAM (37). Что наиболее важно, они показали гораздо более низкие уровни перекрестных помех между четырьмя каналами обнаружения, вызванные низким квантовым выходом флуоресценции донорного флуорофора CYA.

Следующим усовершенствованием стало внедрение «универсальной кассеты ET» (39). Кассету можно добавить к 5′-концу любого праймера.

Помимо секвенирования ДНК, праймеры ET нашли применение для визуализации электрофоретического разделения фрагментов ДНК. Они позволяют одноосновное разрешение для фрагментов дц- и оцДНК (95,96). Они оказались удобными инструментами в этом отношении из-за больших стоксовых сдвигов различных праймеров, что позволяет отличное разделение двух флуоресцентных сигналов.Эти полезные свойства праймеров были использованы для определения размера многоцветных участков с короткими тандемными повторами человека (95). Недавно праймеры ET были использованы в высокопроизводительном анализе для обнаружения микросателлитной нестабильности и потери гетерозиготности, связанной с первичным раком (62). Праймеры ET также использовали для определения активности теломеразы в тесте протокола амплификации теломерных повторов (TRAP) в формате закрытой пробирки. Система устраняет необходимость в пост-ПЦР-обработке, снижая риск переходящего загрязнения (93).Основной принцип для праймеров ET из композиции флуорофор также используется в молекулярных маяках со смещением длины волны (91).

Биосенсоры на основе ДНК, использующие FRET

Область биосенсоров, использующих FRET, является новой. Эти системы могут объединять несколько реакций для обнаружения конкретных аналитов. Биосенсоры на основе ДНК используют более сложные по структуре зонды, чем те, которые используются в других приложениях. Действительно, из трех обсуждаемых здесь примеров два содержат последовательности дезоксирибозима, а третий представляет собой вариант молекулярных маяков с иммобилизацией на поверхности волокон.

Новый аналитический биосенсор использует датчики FRET на основе дезоксирибозима для определения ионов свинца (47) (). Исследование, проведенное в Университете Иллинойса, Урбана-Шампейн, выявило ДНК-олигонуклеотид, который расщепляет субстратную РНК в присутствии свинцового кофактора. В этом анализе они метили каталитическую ДНК с помощью гасителя флуоресценции, тогда как субстрат РНК, частично комплементарный олигонуклеотиду ДНК, метили флуоресцентной меткой. В дуплексе флуоресцентный сигнал подавлялся из-за непосредственной близости гасителя к флуорофору.Однако, если присутствует свинцовый кофактор, происходит расщепление с высвобождением флуоресцентной метки в раствор, что приводит к нарушению FRET и усилению флуоресцентного сигнала. Датчик продемонстрировал 80-кратную селективность по свинцу по сравнению с ионами других двухвалентных металлов. Описанный подход может привести к разработке различных анализов, способных обнаруживать широкий спектр различных аналитов.

Биосенсор дезоксирибозима

Он активируется ионами свинца и сообщает об их присутствии по усилению флуоресценции.

Другой биосенсор, использующий рибонуклеазную активность дезоксирибозима и FRET в качестве репортерного метода, был введен для оценки концентраций эффекторов белка по изменению сигнала флуоресценции (85). В этом подходе используется ранее описанный дезоксирибозим, способный расщеплять химерный олигонуклеотидный субстрат, содержащий единственный встроенный рибонуклеотид. Когда субстрат 5′-мечен донором (флуоресцеином) и 3′-мечен акцептором (тетраметилродамин), его расщепление можно легко обнаружить по увеличению флуоресценции донора.Дезоксирибозим был модифицирован путем стратегического размещения единственного биотина рядом с областью петли, чтобы его связывание со стрептавидином предотвращало соответствующую укладку дезоксирибозима и нарушало расщепление субстрата. Анализ позволил надежно обнаружить стрептавидин в концентрациях менее 1 нМ после продолжительного времени инкубации (приблизительно 1 день). Подход можно модифицировать для оценки концентраций других лигандов.

Волоконно-оптический ДНК-биосенсор использует модифицированные молекулярные маяковые зонды для обнаружения целевых молекул ДНК в реальном времени (52).В нем используется вариация молекулярных маяков с иммобилизацией на поверхности, которые биотинилированы и содержат тетраметилродамин в качестве флуорофора и DABCYL в качестве гасителя (21). Эти маяки были иммобилизованы на поверхности оптического волокна с помощью биотин-авидиновых взаимодействий. Обнаружение их целевой последовательности восстанавливает флуоресценцию тетраметилродамина, которая регистрируется камерой устройства с зарядовой связью (CCD), прикрепленной к флуоресцентному микроскопу. В более ранней версии теста, аналогичной по конструкции, использовалась миллиметровая площадь поверхности оптического волокна (51).Более поздняя модификация привела к созданию ультрамалых (от 100 мкм до субмикронных размеров) биосенсоров ДНК / РНК. Нижние пределы концентрации этих биосенсоров находились в диапазоне 0,3–10 нМ последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (52).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ДНК-зонды, использующие FRET, обнаруживают многие типы реакций с участием ДНК, РНК, белков и неорганических веществ. По конформации зонды могут быть линейными, иметь форму шпильки или иметь более сложную конфигурацию, как в случае дезоксирибозимов. Зонды в форме шпилек представляют собой одну из самых популярных конструкций.Однако важна не только конфигурация датчика. Расположение, количество и природа хромофоров, а также включение специфических последовательностей распознавания и ДНК-ферментов — все это компоненты, используемые при создании новых зондов.

Важным аспектом FRET, делающим его привлекательной технологией в клеточных исследованиях, является его способность обнаруживать и контролировать многие реакции в живых клетках. Это делает этот подход ценным инструментом для будущей визуализации клеточных процессов in vivo.Преимущества ДНК-зондов FRET также используются в новой и быстро развивающейся области биосенсоров.

Еще одним важным приложением является мониторинг амплификации ДНК в ПЦР в реальном времени. Использование FRET позволяет одновременно обнаруживать несколько продуктов и хорошо подходит для клинических диагностических приложений.

Прогресс в области зондов переноса энергии недавно привел к появлению олигонуклеотидных зондов, которые содержат нефлуоресцентные гасители (89–91).В этом случае акцептор нефлуоресцентный, и зонд сообщает об обнаружении мишени исключительно по изменению флуоресценции донора. Практическое преимущество состоит в том, что зонд не требует разделения донорной и акцепторной флуоресценции. Эти реакции темнового переноса основаны на гашении контактов и не требуют спектрального перекрытия, характерного для FRET (90,91). Ценность тушения, не основанного на FRET, и преимущества его комбинированного использования с FRET были признаны в исследованиях белков относительно рано (2,12).Однако ДНК-зонды, использующие комбинацию механизмов передачи энергии FRET и не-FRET, появились только недавно (91).

Это новое направление в разработке зондов представляет собой более широкий подход, ведущий к разработке принципиально новых флуоресцентных олигонуклеотидных зондов. Эти новые конструкции не ограничиваются ограничениями, присущими только FRET или только контактному гашению, а вместо этого объединяют свои преимущества в более универсальном зонде передачи энергии.

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии.Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или под влиянием химических и физических свойств окружающей среды. Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (е.g., ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; поперечно-сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции. Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić). и другие., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально значимых структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Schlichting and Chu, 2000; Schotte et al., 2003). ). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019; Brodie et al., 2019; Чен и др., 2020; Якобуччи и др., 2019; Мураками и др., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функцию и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на 12 порядков во времени и картирования конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. Исследования FRET, исследующие затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Haas and Steinberg, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов исследование структурных неоднородностей на временах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс).Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным. Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018а; Lipman et al., 2003; Маргиттай и др., 2003; Мазаль и Аран, 2019; Michalet et al., 2006; Ореви и др., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять. Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру « динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и для измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner и другие., 2018а; Мазаль и Аран, 2019; Санабрия и др., 2020; Шулер и Хофманн, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2,5–10 нм),
способность разрешать структурные и динамические неоднородности,
высококачественные измерения с низким потреблением образцов интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,
определение структурных переходов в состоянии равновесия, следовательно, без необходимости синхронизации,
возможность обнаруживать (очень) редкие события.Действительно, в биологии наиболее интересными для изучения молекулы часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,
высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, полученных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и
высокая специфичность для остатков / доменов за счет специфической маркировки.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получается согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые не протекают напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018 с разрешения, опубликованного в соответствии с Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,
потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а
раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (Рисунок 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (Рисунок 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (Рисунок 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; Рисунок 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции гена.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы путем разрешения переходов между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

Измерения

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы имеются в продаже, но обычно их изготавливают самостоятельно. Образцы готовятся, а данные собираются с использованием специальных лабораторных протоколов, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для области в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфические для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус в отношении того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензий на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются не попыткой систематизировать сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В завершение мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.

Engineering Dark Chromoprotein Reporter for Photoacoustic Microscopy and FRET Imaging

Общие методы

Все синтетические ДНК-олигонуклеотиды, используемые для клонирования, и библиотеки были приобретены у Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Плазмидная ДНК Miniprep, полимеразные цепные реакции (ПЦР), расщепление рестрикционными ферментами, лигирование и электрофорез в агарозном геле проводили согласно Sambrook et al. ⁴¹ ДНК-полимераза Pfu была получена из Fermentas, используемого для регулярной ПЦР, и набор QuikChange Multi был приобретен у Agilent Technologies и использовался для сайт-направленного мутагенеза.Все рестрикционные ферменты были получены от Fermentas или New England Biolabs. ДНК-лигаза Т4 была получена от Life Technologies. Продукты ПЦР и расщепления очищали с помощью набора для быстрой экстракции из геля QIA (QIAGEN, Валенсия, Калифорния) или набора для экстракции из геля GeneJET (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя. Все секвенирование проводилось в отделе молекулярной биологии Университета Альберты или в основных службах ДНК Университета Калгари. Все фильтры для флуоресцентной визуализации были приобретены у Chroma Technology (Рокингем, Вирджиния), Omega Filters (Браттлборо, Вирджиния) или Semrock (Рочестер, штат Нью-Йорк).

Очищенный белок и

проба E. coli

Клетки E. coli трансформировали электропорацией векторами, содержащими либо mCherry (вектор pBAD / His B от Life Technologies), либо EYFP (усиленный желтый FP) (pRSET- B-вектор от Life Technologies), REACh (pRSET-B), Ultramarine (вектор pQE9N) или cjBlue (pRSET-B). Культуру объемом 4 мл, засеянную одной колонией E. coli , выращивали в течение ночи перед ее разбавлением 250 мл среды (среда LB для mCherry, EYFP и REACh; среда M9 для cjBlue; среда бульона Terrific для Ultramarine), содержащая 0 .1 мг / мл ампициллина. Эту культуру выращивали в 250 мл встряхиваемых колбах с перегородками (37 ° C и 225 об / мин) до желаемой оптической плотности (0,6–0,8). Экспрессию белка индуцировали добавлением 0,02% L-арабинозы (mCherry), 1 мМ IPTG (EYFP и REACh) или 0,2 мМ изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида (Ultramarine и cjBlue). Затем клетки E. coli культивировали при 28 ° C в течение 24 часов для EYFP и REACh, 30 ° C в течение 24 часов для mCherry и Ultramarine или 30 ° C в течение 48 часов для cjBlue. Модель E.coli либо осаждали центрифугированием (10000 g в течение 5 мин) для экспериментов по визуализации PA, либо высевали на чашку с агаром для скрининга PA (описано ниже).

Очищенные белки использовали для сравнения оптических и PA характеристик белка. Для очистки белков mCherry, EYFP и REACh культивированные бактерии подвергали центрифугированию (10000 g в течение 5 мин), затем ресуспендировали в 30 мМ буфере Tris-HCl (pH 7,4). Френч-пресс использовали для лизирования бактерий, и бактериальный лизат подвергали центрифугированию (13000 g в течение 45 минут при 4 ° C).После центрифугирования супернатант собирали и затем применяли аффинную хроматографию Ni-NTA (Agarose Bead Technologies) для экстракции очищенных белков. Затем очищенные белки с Ni-NTA аффинной хроматографии подвергали диализу в 10 мМ MOPS, 100 мМ KCl, pH 7,2 для измерения.

Для очистки CP Ultramarine и cjBlue осажденные клеток E. coli лизировали с помощью разрушителя клеток (Constant Systems), очищали с помощью Ni-NTA хроматографии (Amersham), затем диализовали в фосфатном буферном солевом растворе (PBS, pH 7.4).

Случайный мутагенез и подготовка планшета

E. coli
Случайный мутагенез выполняли с помощью подверженной ошибкам полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в Fromant et al. ⁴². Вкратце, Ultramarine в pQE9N (Qiagen) и cjBlue в pRSET-B (Life Technologies) были амплифицированы с 5′-прямым праймером XhoI и 3′-обратным праймером HindIII с использованием полимеразы Taq (New England Biolabs) в присутствии MnCl. ₂. Библиотеки полноразмерных генов переваривали с помощью XhoI / HindIII (Fermentas) и лигировали в плазмиду pBAD / His B, расщепленную аналогичным образом, с ДНК-лигазой Т4 (Life Technologies).Плазмидные библиотеки экспрессировали в штамме E.coli Dh20B (Life Technologies) на чашках с агаром LB (Luria-Bertani) с добавлением 0,1 мг / мл ампициллина и 0,02% L-арабинозы при 37 ° C в течение ночи. Свежий 0,2% агар накладывали на верхнюю часть колоний перед скринингом PA для уменьшения загрязнения.
Скрининг на основе поглощения
E. coli колоний, экспрессирующих библиотеки Ultramarine или cjBlue, выращивали на 10-сантиметровых чашках Петри. Верхние 20-30 колоний с наиболее темным цветом были вручную собраны в 4 мл среды LB с добавлением 0.1 мг / мл ампициллина и 0,02% L-арабинозы и инкубировали в течение ночи. Экстракты сырого протеина получали с использованием B-PER Protein Extraction Reagen’t (Pierce / Thermo Scientific). 100 мкл сырых белковых экстрактов подвергали тесту на абсорбцию, и спектры (сканирование с длиной волны 400-800 нм) регистрировали с помощью спектрофотометра УФ-видимого излучения DU-800 (Beckman). После сравнения максимального поглощения отбирали 5–10 победителей и использовали их в качестве матрицы для следующего раунда мутагенеза.
Строительство тандема Ультрамарин 7.2 димер
Для создания тандемного димера димер Ultramarine 7.2 в pBAD / His B амплифицировали в двух отдельных реакциях ПЦР. В первой реакции были введены сайты рестрикции 5 ‘XhoI и 3’ PstI. Во второй реакции вводили 5’PstI с линкером и 3’HindIII. Стратегия трехстороннего лигирования обеспечивала тандемный ген формы A-линкер-A в сайтах XhoI / HindIII pBAD / His B, где линкер представлял собой последовательность из 13 остатков (SCSGTGSTGSGSS), которая включала сайт рестрикции PstI.
Характеристика белка
Спектры поглощения исходной и вариантной белковых структур измеряли путем помещения разбавленных образцов в кварцевые микрокюветы диаметром 1 см в спектрофотометр УФ-видимого диапазона DU-800 (Beckman).Коэффициенты молярной экстинкции определяли с использованием измерений абсорбции для серийных разведений белка, известной концентрации белков и уравнения Бера-Ламберта.
мЧерри использовали в качестве эталона для определения квантового выхода CP. Вкратце, были созданы серийные разведения стандарта и белков с оптической плотностью 0,01–0,1. Спектры флуоресценции образцов регистрировали с помощью спектрофлуориметра QuantMaster (Photon Technology International).Квантовый выход может быть определен с помощью уравнения Φ _{образец} = Φ _эталон × (S _{образец} / S _{стандартный}), где Φ представляет квантовый выход, а S представляет собой наклон кривых, полученных путем построения общего интенсивность флуоресценции (интегрированная по длине волны) в зависимости от поглощения.
Фотоакустическая система
На рисунке 1b показана схема экспериментальной установки. Nd: YAG-лазер с модуляцией добротности 10 Гц (SLIII-10, Continuum) и оптический параметрический генератор (SL OPO Plus, Continuum) использовались для генерации длин волн от 450 до 700 нм.Свет вводился в световод (CeramOptec Industries, 900 волокон [диаметр сердцевины 185 мкм, диаметр оболочки 200 мкм, диаметр оболочки 250 мкм], NA = 0,26 / 0,37 ± 0,02) с одним входом и десятью выходами для направления света на образец, гомогенизируйте форму луча и равномерно освещайте образец. Выходы световода были расположены концентрически вокруг сфокусированного ультразвукового преобразователя 25 МГц и 12,7 мм (V324-SM, Olympus Panametrics-NDT) таким образом, чтобы центр светового пятна был совмещен с фокусом преобразователя.Держатель для преобразователя и световода был установлен на моторизованном столике для растрового сканирования и позиционирования преобразователя. Камеру использовали для визуализации образцов, проверки совмещения ультразвука и образца и обнаружения колоний E. coli на чашках с агаром. Для автоматического определения местоположения колоний использовалось преобразование Хафа на основе круга. Это позволяло сканировать по принципу «точка-точка» (от колонии к колонии), а не сканировать растровое изображение, что сокращает время, необходимое для каждой чашки.
Акустические сигналы и сигналы PA, обнаруженные преобразователем, были усилены на 39 дБ с помощью блока импульсного приемника (5073PR, Olympus Panametric NDT) и записаны с помощью карты сбора данных (CS8229, Gage Applied Technologies). Для чересстрочной PA и ультразвуковой визуализации использовалась карта цифрового ввода-вывода (NI CB-2162, National Instruments) для синхронизации ультразвуковой и лазерной систем, аналогично предыдущей работе ⁴³. Сигнал фотодиода был записан и использовался для нормализации сигналов PA.
Для определения характеристик РА очищенные белки или ресуспендированные клеток E. coli (1–10 × 10 ⁹ клеток / мл) разводили в PBS и вводили в пробирку с внутренним диаметром 1,57 мм (PE-205, Intramedic ). Пробирки были запечатаны и помещены под преобразователем для сканирования в M-режиме (одномерное отображение во времени), B-сканирования (двухмерное изображение) и C-сканирования (трехмерное изображение). Для проверки планшетов E. coli было разработано специальное программное обеспечение для интеграции карты сбора данных, цифровой карты ввода-вывода, контроллера движения и камеры для автоматического обнаружения и позиционирования преобразователя над E.coli колоний.
Визуализацию животных проводили путем инъекции 10 мкл 10 ⁷ –10 ⁸ клеток / мл клеток E. coli , продуцирующих CP или их варианты, в заднюю конечность крысы, умерщвленной непосредственно перед визуализацией, или путем инъекции 10 мкл 10 ⁷ –10 ⁸ клеток / мл CP-продуцирующих клеток E. coli в ухо живых крыс. Крысу анестезировали изофлуораном. Визуализация PA началась в течение 30 минут после инъекции. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, установленными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Альберты.
Обработка сигналов и изображений
Обнаруженные PA-сигналы сначала обрабатывались с использованием алгоритма обнаружения огибающей преобразования Гильберта. SNR рассчитывалось с использованием среднего максимального значения огибающего сигнала PA, деленного на стандартное отклонение шума. Для отображения изображений C-сканов были использованы максимальные значения каждого огибающего сигнала и интерполированы с использованием линейной интерполяции. Для разделения различных оптически поглощающих молекул, таких как кровь и ультрамарин или cjBlue, был реализован алгоритм расслоения с использованием ограниченного неотрицательного алгоритма регрессии методом наименьших квадратов.Вся постобработка была сделана в MATLAB.
Конструирование протеазного биосенсора для
in vitro тест
Чтобы сконструировать tdUltramarine2 слияния с EGFP, mPapaya1 и mRuby2 для тестирования протеазной активности, гены флуоресцентных доноров амплифицировали с 5′-прямым праймером XhoI и 3′-KpnI, содержащим линкер. 1 обратный праймер в трех отдельных реакциях ПЦР. Этот линкер 1 представлял собой пептид из 10 остатков GSG DEVD GGT, где DEVD представляет собой последовательность субстрата для каспазы-3.С-конец N-концевого FP заканчивается остатком лизина, который служил сайтом узнавания субстрата для трипсина. Между тем, dUltramarine2 в pBAD / His B амплифицировали в двух отдельных реакциях ПЦР. В первой реакции были введены сайты рестрикции 5 ‘KpnI и 3’ PstI. Во второй реакции вводили 5 ‘PstI с линкером 2 и 3’ HindIII, где линкер 2 представлял собой SCSGTGSTGSGSS с 13 остатками, включая сайт рестрикции PstI, см. 2.4.5 (конструкция tdUltramarine2). Стратегия четырехстороннего лигирования предоставила форму A-линкер 1-B-линкер 2-B в сайтах XhoI / HindIII spBAD / His.spBAD / His B эквивалентен плазмиде pBAD / His B с мутацией A2056C в происхождении pBR322. Было обнаружено, что эта неожиданная мутация увеличивает репликацию плазмиды по крайней мере в 2 раза.
Для создания конструкций FP (, т.е. , EGFP, mPapaya1 и mRuby2) плюс Ultramarine FRET, ген, кодирующий Ultramarine, амплифицировали с 5′-прямым праймером KpnI и 3′-обратным праймером HindIII. Трехстороннее лигирование (A-линкер 1-B) было выполнено в сайтах XhoI / HindIII spBAD / His B. Для достижения полного расщепления трипсином FRET (mPapaya 1-CP и EGFP-CP) мы заменили аминогруппу DE. кислоты в линкере 1 с KK.
Конструирование биосенсора каспазы-3 для визуализации живых клеток
Для экспрессии конструкции FRET в клетках млекопитающих использовали модифицированный вектор pcDNA3.1 (+), разработанный доктором Иданом Дингом ⁴⁴. После модификации вектор имеет сайты рестрикции XhoI и HindIII в той же рамке считывания, что и тот же сайт в векторе pBAD / His B. Все конструкции FRET, содержащие субстрат DEVD расщепления каспазой-3, обрабатывали XhoI и HindIII и лигировали аналогичным образом обработанной модифицированной pcDNA3.1 (+) вектор.
Общие методы визуализации живых клеток
Все плазмиды экспрессии клеток млекопитающих очищали с использованием набора Plasmid Miniprep (Qiagen). Клетки Hela (линия CCL2; ATCC) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Life Technologies) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Sigma), 2 мМ GlutaMax (Life Technologies) и пенициллин-стрептомицин при 37 °. C и 5% CO ₂ в соответствии со стандартными процедурами. Временную трансфекцию проводили с использованием Turbofect ^TM (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя.Обычно клетки в чашках для визуализации диаметром 35 мм трансфицировали 1 мкг плазмидной ДНК, смешанной с 2 мкл реагента для трансфекции. Визуализацию проводили через 24–48 ч после трансфекции при комнатной температуре в HEPES-буферном солевом растворе Хэнка (HHBSS).
Визуализация апоптоза, индуцированного стауроспаурином
Чтобы инициировать апоптоз, клетки обрабатывали 2 мкМ стауроспорином и инкубировали еще 60–90 минут перед визуализацией. Визуализацию проводили на микроскопе Axiovert 200 M (Zeiss), оснащенном ксеноновой лампой мощностью 75 Вт и линзой объектива 20x (NA = 0.75, воздух) и 14-битную охлаждаемую CCD-камеру CoolSnap HQ2 (Photometrics), управляемую программным обеспечением Micro-Manager с открытым исходным кодом. Для типичного эксперимента изображения записывались с интервалом в 1 минуту.
Цель
теперь будет достигаться в День благодарения каждый год
Является ли это признаком постпандемического мира? Возможно. Target только что сделала огромное объявление о том, как они собираются решать вопросы Дня Благодарения в будущем.
Если вы помните, еще в 2020 году несколько крупных магазинов объявили, что будут закрыты на праздник, решив распределить свои большие продажи с течением времени, чтобы избежать скопления людей в условиях пандемии COVID-19 и дать сотрудникам перерыв после тяжелого года.Target был одним из таких магазинов.
Ранее в этом году, всего через несколько месяцев после закрытия на День Благодарения, они объявили, что будут закрыты на праздник еще раз в 2021 году. Они явно были поклонниками изменений, объявив об этом почти за год до фактического праздника. в середине января.
На момент объявления они заявили, что получили положительные отзывы о внесенных ими изменениях от гостей и хотели бы применить их снова в этом году. Теперь это навсегда.
KARE 11 сообщила в новостях в понедельник (22 ноября) после объявления сети из Миннесоты о том, что они будут вносить большие изменения в будущем. Они являются первым крупным розничным продавцом, который пошел на этот шаг.
Покупатели не должны волноваться, особенно те, кто любит ходить по магазинам в ночь на День Благодарения, чтобы заключить сделки. В прошлом году в магазине было много выгодных покупок, несмотря на то, что он был закрыт в праздничные дни. В этом году они уже начали выпускать предложения, которые вы можете покупать в магазине, в Интернете или в их приложении.
Посмотрим, какие еще большие изменения они внесут, если таковые будут, в этот праздничный сезон. Я уверен, что другие крупные розничные торговцы, как я уже упоминал, будут стремиться последовать их примеру. Я не удивлюсь, если это станет новой нормой для всех подобных крупных розничных сетей.
В прошлом году магазины Best Buy и Kohl’s and Dick’s Sporting были закрыты в День Благодарения. В июне магазины Walmart и Sam’s Club объявили, что в этом году они закроются на День Благодарения, как и в прошлом году. Посмотрим, кто последует этому примеру в ближайшие недели.
Вот 50 ваших любимых торговых сетей, которых больше нет.
Минато — Тамачи — Минато — Прохождение | Шин Мегами Тенсей V
Это прохождение Da’at: Minato of Shin Megami Tensei V, действие которого происходит в районе Тамачи. Как выполнить все задачи, найти каждый сундук и найти каждого мимана.
Вы начинаете свое путешествие в Тамачи, Минато.
Демоны
шт.
бусина возрождения

Имя
500 Macca
Revival Bead
Preta’s Essence
Лекарство x2
Сущность слизи
Огненный осколок
«
‹
1
›
»
Квестов¶
Добро пожаловать в мир преисподней¶
Вы проснетесь и окажетесь в бесплодной пустоши и, похоже, на достопримечательности Токио, такие как уличные знаки и сам туннель Таканава.Как только вы восстановите контроль, вам останется только двигаться вперед по песку, пока не активируете сцену. Когда на вас нападают Демоны, и вся надежда кажется потерянной, появляется любопытное существо, чтобы оказать помощь, и вам будет предоставлен выбор. Неважно, что вы выберете здесь, вы не можете отказаться от его помощи (да и не захотели бы), и вы оба объединитесь, чтобы стать существом, известным как Нахобино, и вас бросят в первую битву.
Вы получите краткое изложение того, как работает боевая система Press Turn в Shin Megami Tensei V.Если вы посмотрите в верхний правый угол экрана, вы заметите синий значок, который указывает, сколько ходов у вас есть в наличии. Все демоны, как союзники, так и враги, имеют слабости и сопротивления, и нанесение удара по слабости заставит один из ваших ходов пульсировать. Это, в свою очередь, предоставит вам дополнительный ход, однако пульсирующий значок никогда не может быть расширен, это означает, что, если у вас есть группа из четырех человек, у вас может быть до 8 ходов в раунд, если вы четыре раза поразите слабость.
(1 из 3) Главное здесь — использовать слабости врагов
Это остается верным для врага, если он поразит слабость любого из вашей группы, он получит дополнительный ход, поэтому важно всегда обращать внимание на ваше сопротивление и слабости.Если противник должен обнулить, поглотить, отразить или вы пропустите атаку, вы потеряете два хода, поэтому убедитесь, что вы всегда используете правильные элементы. На данный момент у вас есть команда Атака, доступная вам только в первом раунде. Второй раунд позволит вам использовать Zio , слабость этого Демона, и даст вам дополнительный ход. Вам нужно будет внимательно следить за своим MP, поскольку последнее, что вам нужно, — это исчерпать его все за один бой.
После битвы вы получите свое первое повышение уровня, а когда дело доходит до Нахобино, у вас будут очки, случайным образом распределенные по вашей статистике, за исключением одного, с которым вы можете поиграть.Фактически, это то, как вы решаете, какую сборку вы хотите использовать для своего Nahobino. Хотя у вас не так много свободы, как в других основных играх, со временем сосредоточение на статистике ваших очков позволит вам сосредоточиться либо на силе, либо на магической сборке (и вы должны выбрать навыки, которые соответствуют этому стилю игры).
Хотя в Shin Megami Tensei IV магия была, пожалуй, лучшей характеристикой, на которой нужно сосредоточиться, и Shin Megami Tensei III: Nocturne, Physical, здесь оба чрезвычайно жизнеспособны.Вы всегда можете восполнить любые недостатки демонов для других членов вашей группы, поэтому постарайтесь не слишком беспокоиться по этому поводу и просто придерживайтесь того параметра, на котором вы сосредоточены. Как только вы достигнете более поздних этапов игры, страницы Best Physical Build и Best Magical Build помогут указать вам, какие навыки вы должны иметь в виду.
У вас есть шанс задать больше вопросов после битвы, ответить, как вы будете, и раскроете его имя как Аогами, Протодемон.На этом этапе вы получите доступ к экрану карты, который будет жизненно важным инструментом при исследовании Нижнего мира. Нажмите вперед, и игра проинформирует вас о том, как путешествовать по миру, а затем, наконец, о Магацухи. Когда вы путешествуете по Нижнему миру, вы увидите кристаллизованные формы Магацухи, и они бывают следующих типов:
Цвет Эффект
Зеленый Восстанавливает HP
Желтый Восстанавливает MP
Красный Заполняет шкалу Магацухи (требуется для специальных навыков)
Важно, чтобы вы использовали их, так как вам нужно будет управлять своими HP и MP между точками сохранения, и это действительно будет удобно.Собирайте Магацухи, продвигаясь вперед, а затем научитесь преодолевать препятствия. Вам нужно будет использовать кнопку прыжка, чтобы получить доступ ко всем локациям на протяжении всего вашего путешествия, области открыты, и есть много секретов, которые нужно открыть. Продолжая движение на север, вы обнаружите красную платформу, известную как точек лазания , и вы сможете прыгать и взбираться вверх, они также будут отмечены на вашей карте.
Когда вы достигнете вершины этой области, вы встретите сундук с сокровищами , он содержит любое количество полезных предметов, но часто содержит сущности, о которых вы скоро познакомитесь.Поднимаясь на холм, вы узнаете, что когда-то он назывался Токио (о чем свидетельствует башня Токио вдалеке), но с тех пор прошло время. Аогами предлагает отправиться в Токийскую башню, чтобы восстановить свою память, чтобы он мог лучше ответить на ваши вопросы, тем самым начиная «Песнь о земле».
Земля земли (1)
Это хорошее время, чтобы открыть меню, вы сможете проверить и использовать любые предметы, которые у вас есть, посмотреть и использовать свои навыки или проверить статус своей группы. Вы также найдете экран квестов; это отобразит как ваши основные квесты, так и ваши дополнительные второстепенные квесты.Как только вы будете готовы, спуститесь по склону, и вы увидите светящийся столб света, известный как Leyline Fount , и когда вы войдете в контакт с ним, вас унесет в другое место. Это Лощина Кадавра, и вы встретите Гюстава, босса Миманов, который будет торговцем в Shin Megami Tensei V.
.
(1 из 2) Leyline Founts предлагают передышку от суровых пустошей Netherworld
Leyline Founts предлагают передышку от суровых пустошей Netherworld (слева), подумайте о покупке некоторых подзорных труб в магазине Gustave здесь.(справа)

Имя Эффект Цена
Медицина Незначительное восстановление HP на 1 союзника. 50
Сода Амрита Вылечить статусные недуги на 1 союзнике. 80
Revival бусина Восстановите 1 союзника до половины здоровья. 400
Огненный осколок Weak Fire атакует всех противников. 200
Осколок льда Weak Ice атакует всех противников. 200
Осколок Элек Слабая электрическая атака всех противников. 200
Осколок силы Weak Force атакует всех противников. 200
Световой осколок Weak Light атакует всех противников. 200
Темный осколок Weak Dark атакует всех противников. 200
Противопожарный клапан Обнуляет огненную атаку всех союзников на 1 ход. 150
Демпфер для льда Обнуляет ледяную атаку против всех союзников на 1 ход. 150
Elec Демпфер Обнуляет электрическую атаку всех союзников на 1 ход. 150
Демпфер силы Обнуляет Силовую атаку против всех союзников на 1 ход. 150
Демпфер света Обнуляет легкую атаку против всех союзников на 1 ход. 150
Темный демпфер Обнуляет атаку тьмы на всех союзников на 1 ход. 150
Подзорная труба Показывает информацию для 1 врага. 100
«
‹
1
2
›
»
В настоящее время в вашем распоряжении не так много средств, но подумайте о покупке нескольких подзорных труб, они на вес золота, если вы встретите на поле несколько редких митамов.Когда вы уходите, Гюстав просит вас помочь разыскать его пропавших миманов, и вы найдете 200 из них по всему Преступному миру в самых разных местах. Гюстав, конечно, наградит вас за первого, который вы найдете, затем на 5, вы найдете (1, 5, 10, 15 и так далее), и награды очень стоят вашего времени. Это пошаговое руководство будет указывать на них повсюду, или вы можете перейти в раздел Miman , чтобы найти их, отсортированные по области.
Как только вы вернетесь в Нижний мир, вы получите доступ к параметрам Хроники Дела (сохранение игры), Лощина трупа (Магазин Гюстава) и Восстановление (восстановление HP и MP за счет Макки).Shin Megami Tensei V иногда может быть жестокой игрой, поэтому обязательно совершайте частые походы в эти Leyline Founts, чтобы сохранить свою игру или восстановить свой MP. На данный момент Гюстав дал вам задание, и вы найдете Miman # 1 прямо перед Лейлинией к северу, и, поговорив с ним, вы получите 5 Славы , валюту, о которой вы скоро узнаете. .
Вернитесь к Гюставу, чтобы сообщить новости, и он передаст Сущность Онмораки . Это еще кое-что, о чем вы скоро узнаете больше, так что выбросьте это сейчас из головы.Вы получите следующую награду от Гюстава за 5 миманов, а затем награду за каждые следующие 5. Когда вы покинете Leyline, идите на север, посмотрите на дорожку и поднимитесь по лестнице справа, здесь вас ждет Miman # 2 . Теперь посмотрите на западную стену, и вы найдете освещенный торговый автомат, осмотрите это, чтобы получить Relic . Вы можете вспомнить, как Гюстав упоминал об этом, и он купит их у вас и станет вашим основным средством приобретения Макки в Shin Megami Tensei V, помня об этом, настойчиво ищите их, когда это возможно.
Содержимое будет возрождаться со временем, посмотрите на карту, чтобы увидеть, загорелся ли значок.
Когда вы приблизитесь к пикси перед вами, Аогами сообщит вам, что вы можете нанимать демонов, чтобы они сражались за вас, разговаривая с ними в бою. Далее следует руководство, в котором вы узнаете, что вам нужно отвечать на вопросы, основанные на характере Демона, чтобы привлечь его к переговорам. Если вы не ответите на вопросы, вы потеряете свой ход, и начнется ход врага (в некоторых случаях они могут покинуть битву).Как только вы произведете на них впечатление, достаточное для того, чтобы они начали переговоры, они будут просить у вас предметы, Macca, HP и MP в случайном порядке. Умиротворение их заставит их присоединиться к вашей группе и добавить их в ваш запас демонов (из которых у вас есть ограничение в 6 для начала).
Чтобы уменьшить опасность провала переговоров, всегда сначала побеждайте других Демонов в битве и оставляйте только того, которого вы хотите нанять. Таким образом, если вы проиграете, вы пострадаете от атак только одного врага.
Пикси присоединится к вашей группе после этой битвы, она полезна, потому что у нее есть доступ к Диа, который может вас исцелить.В ваших интересах всегда пытаться вербовать новых демонов, с которыми вы встречаетесь, их можно будет зарегистрировать позже и отозвать за определенную плату. Не привязывайтесь слишком к своим демонам, вам следует стремиться менять их каждые 2-5 уровней новыми демонами, если только один особо не выделяется. Уровни имеют огромное значение в формуле урона.
По мере того, как вы продолжаете идти вперед, вы обнаружите впереди двух слаймов, и Аогами сообщает вам, что в ваших интересах начинать битву, ударив их, это дает вам шанс начать битву первым.Слаймы — слабые демоны, и вы можете использовать практически любой элемент, однако пока подумайте о том, чтобы поговорить с ним и нанять его, вам нужно как можно быстрее получить полную группу из 4 человек. Как только битва закончится, обнимите восточный край карты и возвращайтесь на юг, чтобы найти сундук с сокровищами, содержащий бусину возрождения .
(1 из 6) Обыщите все торговые автоматы, которые вы найдете, и найдите реликвии для продажи Гюставу
.
Продолжайте движение на север до перекрестка, и вы найдете два торговых автомата в центре.Ваша цель — на северо-восток, но сначала идите на северо-запад, придерживаясь восточной стороны пути, и вы сможете пройти под зданием, чтобы найти Miman # 3 . Сразу после этого вы столкнетесь с некоторыми претами на дороге, они слабы к огню и могут быть неприятными, если у вас все еще есть только пикси, но со слизью в вашей группе, у вас будет достаточно демонов, чтобы победить одного и, надеюсь наймите другого, чтобы у вас наконец-то была полноценная вечеринка.
Когда битва закончится, направляйтесь на запад вверх по холму, а затем идите на юг, чтобы добраться до руин и найти сундук с сокровищами, содержащий Сущность Преты .Вернитесь на главную дорогу и перейдите на восток, чтобы найти Miman # 4 , сидящую у упавшего здания. Теперь бегите по этому зданию и спрыгивайте в конце, чтобы добраться до внутренней части здания, в котором находится еще один сундук с сокровищами, содержащий Лекарств x2 . Впереди несколько пикси возле дерева, и если вы посмотрите на запад, вы найдете еще два торговых автомата.
Когда вы вернетесь на главную дорогу, вы найдете еще одно разрушенное здание с западной стороны и внутри, Miman # 5 , этого хватит для вашей следующей награды, когда вы посетите Гюстав.Разбейте сундук с сокровищами на севере, чтобы получить Сущность слизи , а затем нырните в пещеру, чтобы обнаружить группу Прета, с которой вы можете взаимодействовать, и начните Подквест A Preta Pedicament. Всевозможные Демоны будут предлагать Подзапросы в Мире Преисподней, и вы не только получите много опыта за их выполнение, но и часто талисманы, которые открывают навыки или способности для специальных сплавов. В этом конкретном субквесте вам нужно найти пропавшего Прета, однако он не находится в Тамачи, поэтому вам нужно подождать, пока вы закончите это.
Если вы обыщете восточную сторону этой пещеры, вы найдете сундук с сокровищами, окруженный большой группой слизней. Бегите внутрь, возьмите Fire Shard , затем бросайтесь прочь, чтобы избежать неприятной встречи. На данный момент вы полностью изучили северо-запад Тамачи, так что направляйтесь на северо-восток на перекрестке, и вы вызовете сцену с любопытным Демоном, прежде чем вас бросят в бой против трех Pretas .
Здесь вас научат навыкам Магацухи, о чем свидетельствует шкала Магацухи в правом верхнем углу меню боя.Это немного поднимается каждый ход или за счет сбора красных кристаллов магатуши в мире. Как только шкала заполнится, вы можете получить доступ к этим навыкам в нижней части Нахобино или в списке навыков демона. При его использовании они также не используют поворот, поэтому это очень мощные инструменты, которые вам следует использовать. На данный момент у вас есть доступ только к Омагатоки: Критический , но, возможно, это один из самых полезных в игре, вам придется подождать, пока вы найдете талисманы, чтобы разблокировать больше. Этот навык Магатуши сделает каждую используемую вами атаку критической (включая магию, которая обычно не может быть критической) и, таким образом, дает вам дополнительный ход для каждой из ваших атак, если вы не промахнетесь или не обнулите атаку.
Независимо от того, как вы ответите демону после битвы, Аогами предлагает вам игнорировать ее, и она уходит. Продолжайте нажимать вперед, и справа от вас будет больше Pretas и торговый автомат. Сразу после этого находятся онмораки, которые слабы к навыкам льда и силы и являются хорошей заменой слизи в вашей группе, если вам удастся ее нанять. Впереди следующий Leyline Fount и регион Mita, вы активируете сцену и разблокируете новую мощную функцию, которая более подробно обсуждается на следующей странице.
ЕЖЕГОДНЫЙ ШАР BLACK FRET BALL, 7 ДЕКАБРЯ НА ACL LIVE
[fusion_builder_container 100_percent = «нет» 100_percent_height = «нет» 100_percent_height_scroll = «нет» 100_percent_height_center_content = «да» equal_height_columns = «no» menu_anchor = «» hide_on_mobile = «small-status» visibility, medium-visibility, medium-visibility, medium-visibility, medium-visibility, medium-visibility, medium-visibility опубликовано «publish_date =» «class =» «id =» «border_size =» «border_color =» «border_style =» solid «margin_top =» 0px «margin_bottom =» 0px «padding_top =» 0px «padding_right =» «padding_bottom =» 0px ”Padding_left =” ”gradient_start_color =” ”gradient_end_color =” ”gradient_start_position =” 0 ″ gradient_end_position = ”100 ″ gradient_type =” linear ”radial_direction =” center ”linear_angle =” 180 ″ background_color = ”” background_image = ”” background_position = ”center center «background_repeat =» no-repeat «fade =» no «background_parallax =» none «enable_mobile =» no «parallax_speed =» 0.3 ″ background_blend_mode = ”none” video_mp4 = ”” video_webm = ”” video_ogv = ”” video_url = ”” video_aspect_ratio = ”16: 9 ″ video_loop =” yes ”video_mute =” yes ”video_preview_image =” ”filter_hue =” 0 ″ filter_saturation = «100 ″ filter_brightness =» 100 ″ filter_contrast = »100 ″ filter_invert =» 0 ″ filter_sepia = »0 ″ filter_opacity =» 100 ″ filter_blur = »0 ″ filter_hue_hover =» 0 ″ filter_saturation_hover = «100 ″ filter_contrast 100ness_hover = = ”100 ″ filter_invert_hover =” 0 ″ filter_sepia_hover = ”0 ″ filter_opacity_hover =” 100 ″ filter_blur_hover = ”0 ″] [fusion_builder_row] [fusion_builder_column type =” 1_1 ″ layout = ”1_1 ″ интервал =” ”” center_content = ”” Target = ”_ self” min_height = ”” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая видимость” class = ”” id = ”” background_image_id = ”” hover_type = ”none” border_size = ”0 ″ border_color = ”” Border_style = ”solid” border_position = ”all” border_radius_top_left = ”” border_radius_top_right = ”” border_radius_bottom_right = ”” border_radius_bottom_left = ”” box_shadow = ”no” box_sha dow_vertical = ”” box_shadow_horizontal = ”” box_shadow_blur = ”0 ″ box_shadow_spread =” 0 ″ box_shadow_color = ”” box_shadow_style = ”” padding_top = ”0px” padding_right = ”” ”padding_bottom_” ”” ””_left_left =” ”” padding_left_left = ”” ””_left_left ”” Background_type = ”single” gradient_start_color = ”” gradient_end_color = ”” gradient_start_position = ”0 ″ gradient_end_position =” 100 ″ gradient_type = ”linear” radial_direction = ”center” linear_angle = ”180 ″ background_color =” ”background_image =” ”background_position = «Слева вверху» background_repeat = «без повтора» background_blend_mode = «none» animation_type = «» animation_direction = «left» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = »» filter_type = «обычный» filter_hue = »0 ″ filter_saturation =» 100 ″ filter_brightness = »100 ″ filter_contrast =» 100 ″ filter_invert = »0 ″ filter_sepia =» 0 ″ filter_opacity = »100 ″ filter_blur =» 0 ″ Filter_hue_hover = »0 ″ filter_saturation_hover =» 100 ″ filter_brightness_hover = »100 ″ filter_contrast_hover =» 100 ″ filter_invert_hover = »0 ″ filter_sepia_hover =» 0 ″ filter_opacity_hover = »100 ″ fusion_black_hover =» 100 ″ fusion_black_hover [столбцы] = ”” Column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”” rule_color = ”” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” animation_type = ” «Animation_direction =» left «animation_speed =» 0.3 ″ animation_offset = ””]
Изображение вверху: команда Black Fret, наставники и номинанты на Black Fret Ball 2018
[/ fusion_text] [/ fusion_builder_column] [fusion_builder_column type = ”2_3 ″ layout =” 1_1 ″ spacing = ”” center_content = ”no” link = ”” target = ”_ self” min_height = ”” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая видимость »class =» »id =» »background_image_id =» »hover_type =« none »border_size =» 0 ″ border_color = »» border_style = «solid» border_position = «все» border_radius_top_left = «» border_radius_top_right = ”” Border_radius_bottom_right = ”” border_radius_bottom_left = ”” box_shadow = ”no” box_shadow_vertical = ”” box_shadow_horizontal = ”” box_shadow_blur = ”0 ″ box_shadow_ spreadpx =” 0 ″ box_shadow_color ”=” ” padding_bottom = «» padding_left = «» margin_top = «0px» margin_bottom = «» background_type = «single» gradient_start_color = «» gradient_end_color = «» gradient_start_position = «0» gradient_end_position = «100 ″ gradient_type =» linear «radial_direction =» center » linear_angle = «180 ″ background_color =» «background_image =» «background_position =» left top «background_rep есть = «без повтора» background_blend_mode = «none» animation_type = «» animation_direction = «left» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ”” filter_type = «normal» filter_hue = »0 ″ filter_saturation =» 100 ″ filter_brightness = »100 ″ filter_contrast =» 100 ″ filter_invert = »0 ″ filter_sepia =» 0 ″ filter_opacity = »100 ″ filter_blur =» 0 ″ Filter_hue_hover = ”0 ″ filter_saturation_hover =» 100 ″ filter_brightness_hover = »100 ″ filter_contrast_hover =» 100 ″ filter_invert_hover = »0 ″ filter_sepia_hover =» 0 ″ filter_opacity_hover = »100 ″ fusion_blackdit = ”Text” Rotation_effect = ”bounceIn” display_time = ”1200 ″ highlight_effect =” circle ”loop_animation =” off ”highlight_width =” 9 ″ highlight_top_margin = ”0 ″ before_text =” ”rotation_text =” ”highlight_text =” ”after_text =” ” hide_on_mobile = «малая видимость, средняя видимость, большая видимость» class = «» id = «» content_align = «center» size = «1 ″ font_size =» 24px «animated_font_size =» «line_height =» 25px «letter_spacing =» ”Margin_top =” ”margin_bottom =” ”margin_top_mobile =” ”margin_bottom_mobile =” ”text_color =” ”animated_text_color =” ”highlight_color =” ”style_type =« none »sep_co lor = ””]
На сумму более 1 доллара США.5 миллионов грантов и прямых выплат, сделанных остинским артистам,
Black Fret продолжает расширять возможности артистов и поддерживать местную музыку;
2019 Black Fret Ball предоставит дополнительные гранты в размере 250 000 долларов 20 артистам
[/ fusion_title] [fusion_text columns = ”” column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”” rule_color = ”” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = » ”Id =” ”animation_type =” ”animation_direction =” left ”animation_speed =” 0.3 ″ animation_offset = ””]
(Остин, Техас — 13 ноября 2019 г., источник: Juice Consulting) — Некоммерческая организация Black Fret из Остина с гордостью объявляет о шестом ежегодном бале Black Fret Ball, который состоится в субботу, 7 декабря, на ACL Live в отеле Moody. Театр (310 W. Willie Nelson Blvd, Остин, Техас 78701). Двери на мероприятие в 18:00. и программа начнется в 19:00. Представители СМИ приглашаются на специальную красную ковровую дорожку, которая начинается в 17:00. острый. Black Fret Ball — это ежегодное мероприятие некоммерческой организации, на котором артисты, номинированные на 2019 год, будут награждены желанным грантом Black Fret.На мероприятии также выступят более десятка номинантов Black Fret 2019 года. Желающие посетить Black Fret Ball могут стать участниками Black Fret, зарегистрировавшись на сайте www.blackfret.org/join; и все членства в Black Fret обеспечивают вход для участника и гостя на все предстоящие мероприятия Black Fret. Для получения дополнительной информации о Black Fret посетите сайт www.blackfret.org.
номинантов Black Fret 2019 года: A. Sinclair, Altamesa, Beat Root Revival, Black Pumas, Cari Hutson & Good Company, Cilantro Boombox, Dave Scher, Dr.ДЖО, Эрика Веннерстром, Go Fever, Good Field, Джонатан Террелл, Ley Line, Superfónicos, Сидней Райт, КГБ Техаса, The Watters, Think No Think, Tje Austin и Western Youth.
В этом году Black Fret Ball будет спонсироваться Dell , Deloitte , Ben E. Keith , Domain Northside , Notley , Cam Solar , Personify , GSD & M , , KUTX , ACL Live в Moody Theater , Good Wolf Productions и Juice Consulting .
«Black Fret — отличный способ отпраздновать и поддержать нашу местную музыку», — сказал Мэтт Отт , соучредитель Black Fret . «И Black Fret Ball — невероятный способ испытать это. Увидеть, как более 15 групп выступают на одной сцене за одну ночь, привнося все свое разнообразное звучание на ACL Live в Moody Theater, является огромным свидетельством широты таланта и потрясающей музыки, создаваемой в нашем городе ».
«Каждый год, когда наши участники делают шаг вперед, чтобы присоединиться к Black Fret или продлить свое членство, это имеет огромное значение для нашего города и его музыкантов», — сказал Колин Кендрик , основатель Black Fret .«Остин без музыки — совсем другое место. Наша задача — убедиться, что мы ценим и поддерживаем все, что делает наш город таким замечательным. Я горжусь тем, что Black Fret смогли оказать положительное влияние на жизнь стольких музыкантов и меломанов ».
[/ fusion_text] [fusion_imageframe image_id = ”5709 | full” max_width = ”” style_type = »bottomomshadow» blur = »” stylecolor = ”” hover_type = ”liftup” Borderize = ”” bordercolor = ”” borderradius = ”” align = ”Center” lightbox = ”yes” gallery_id = ”” lightbox_image = ”” lightbox_image_id = ”” alt = ”Annual Black Fret Ball” link = ”” linktarget = ”_ self” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая- видимость ”класс =” ”id =” ”animation_type =” ”animation_direction =” left ”animation_speed =” 0.3 ″ animation_offset = ””] https://blackfretorg.stage.site/wp-content/uploads/2019/11/annual-black-ball.jpg [/ fusion_imageframe] [fusion_text columns = ”” column_min_width = ”” column_spacing = «» Rule_style = «default» rule_size = «» rule_color = «» hide_on_mobile = «small-visibility, medium-visibility, large-visibility» class = «» id = «» animation_type = «» animation_direction = «left» animation_speed = » 0,3 ″ animation_offset = ””]
Кадр за кулисами с Black Fret Ball 2018
[/ fusion_text] [fusion_text columns = ”” column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”” rule_color = ”” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая видимость” class = » ”Id =” ”animation_type =” ”animation_direction =” left ”animation_speed =” 0.3 ″ animation_offset = ””]
Black Fret — это общественная благотворительная организация со штаб-квартирой в Остине, чья миссия — дать музыкантам возможность создавать и исполнять отличную новую музыку. Организация представляет собой новаторское развитие старой модели патронажа симфонических оркестров, ориентированной на поддержку популярной местной музыки. На сегодняшний день Black Fret предоставил почти 1,5 миллиона долларов в виде грантов и прямых выплат местным группам в Остине. Получатели грантов Black Fret открывают свои грантовые доллары, сочиняя, записывая и исполняя новую музыку, а также предоставляя общественные услуги другим некоммерческим организациям.
В дополнение к своим грантам все номинанты Black Fret по-прежнему имеют доступ к индивидуальному наставничеству Консультативного совета Black Fret, в который входят некоторые из ведущих лидеров музыкальной индустрии Остина. Советники: Марк Аддисон , Хизер Олден , Коди Аллен , Рогги Баер , Эван Блан , Пэт Кэссиди , Рини Коллинз , Майк Кроули Дендиус , Майк Кроули , , CJ Eiriksson , Джим Ино , Дэнни Гиллеспи , Том Гимбл , Уилл Хоффман , Террани Джонсон , Лейн Лауритцен , Лоу , Тед Лоу , Тед Лоу , Мэтт Новески , Тим Палмер , Майкл Рамос , Питер Шварц , Крис «Френчи» Смит , Карлос Соса , Джо Сталлоне , Стюарт Салливан , Стюарт Салливан , Дик Ривз , Грэм Уильямс , Кевин Уоммак и Расти Загст .Дополнительную информацию см. Здесь: Black Fret Advisors
[/ fusion_text] [/ fusion_builder_column] [fusion_builder_column type = ”1_3 ″ layout =” 1_3 ″ last = ”yes” spacing = ”yes” center_content = ”no” hide_on_mobile = ”no” background_color = ”# 000000 ″ background_image =” ”Background_repeat =” no-repeat ”background_position =” left top ”hover_type =” none ”link =” ”border_position =” all ”border_size =” ”border_color =” ”border_style =” solid ”padding_top =” 20px ”padding_right =” 20px «Padding_bottom =» 20px »padding_left =« 20px »margin_top =« 0px »margin_bottom =» »animation_type =« 0 »animation_direction =« down »animation_speed =» 0.1 ″ animation_offset = ”” class = ”” id = ”” min_height = ””] [fusion_title margin_top = ”0px” margin_bottom = ”” hide_on_mobile = ”малый, средний, большой» class = ”” id = ”” Size = ”3 ″ content_align =” center ”style_type =” none ”sep_color =” # ffffff ”] Станьте участником [/ fusion_title] [fusion_button link =” https://blackfretorg.stage.site/membership/ ” title = «» target = «_ self» alignment = «center» modal = «» hide_on_mobile = «малая видимость, средняя видимость, большая видимость» class = «» id = «» color = «default» button_gradient_top_color = «» button_gradient_bottom_color = ”” button_gradient_top_color_hover = ”” button_gradient_bottom_color_hover = ”” accent_color = ”” accent_hover_color = ”” type = ”” bevel_color = ”” border_width = ”” size = ”” stretch = ”default” icon = ”” icon_position = ”left icon_divider = «нет» animation_type = «» animation_direction = «up» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ”” border_radius = ””] Присоединяйтесь к Black Fret [/ fusion_button] [fusion_separator style_type = ”single solid” top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” icon_circle_color = ”” width = ”” alignment = ”center” class = ”” id = ”” /] [fusion_title margin_top = ”0px” margin_bottom = ”” hide_on_mobile = »малозаметный, средний, большой -visibility ”class =” ”id =” ”size =” 3 ″ content_align = ”center” style_type = ”none” sep_color = ”# ffffff”] Станьте волонтером [/ fusion_title] [fusion_button link = ”https: // blackfretorg .stage.site/membership/volunteer/ «title =» «target =» _ self «alignment =» center «modal =» «hide_on_mobile =» малая видимость, средняя видимость, большая видимость «class =» «id =» » color = ”default” button_gradient_top_color = ”” button_gradient_bottom_color = ”” button_gradient_top_color_hover = ”” button_gradient_bottom_color_hover = ”” accent_color = ”” accent_hover_color = ”” type = ”” bevel_color = ”” border_width = ”” size = ” icon = «» icon_position = «left» icon_divider = «no» animation_type = «» animation_direction = «up» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ”” border_radius = ””] Доброволец [/ fusion_button] [fusion_separator style_type = ”single solid” top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” Icon_circle_color = ”” width = ”” alignment = ”center” class = ”” id = ”” /] [fusion_title size = ”3 ″ content_align =” center ”style_type =” none ”sep_color =” # ffffff ”margin_top = ”0px” margin_bottom = ”” class = ”” id = ””] Подключиться к Black Fret [/ fusion_title] [fusion_social_links icons_boxed = ”yes” icons_boxed_radius = ”4px” icon_colors = ”# 000000 ″ box_colors =” # af0000 ″ tooltip_placement = ”” Rss = ”” facebook = ”https: // www.facebook.com/BlackFret/ ”twitter =” https://twitter.com/Blackfret ”instagram =” https://www.instagram.com/blackfret/ ”dribbble =” ”google =” ”linkedin =” ”blogger = ”” Tumblr = ”” reddit = ”” yahoo = ”” deviantart = ”” vimeo = ”https://vimeo.com/channels/blackfret” youtube = ”https://www.youtube.com/channel/UCiHAEss8uL3AEIsS54Uj9TA” pinterest = «» digg = «» flickr = «» forrst = «» myspace = «» skype = «» paypal = «» dropbox = «» soundcloud = «» vk = «» email = «[email protected] «show_custom = «No» alignment = «center» class = «» id = «» /] [fusion_separator style_type = «single solid» top_margin = «20px» bottom_margin = «20px» sep_color = «# ffffff» border_size = «» icon = » ”Icon_circle =” ”icon_circle_color =” ”width =” ”alignment =” center ”class =” ”id =” ”/] [fusion_title margin_top =” 0px ”margin_bottom =” ”hide_on_mobile =” малая видимость, средняя видимость, large-visibility ”class =” ”id =” ”size =” 3 ″ content_align = ”center” style_type = ”none” sep_color = ”# ffffff”] Последние новости [/ fusion_title] [fusion_recent_posts layout = ”default” hover_type = ” none ”columns =” 1 ″ Number_posts = »3 ″ offset =» 0 ″ cat_slug = »news» exclude_cats = »» thumbnail = «no» title = »yes» meta = «no» excerpt = «no» excerpt_length = »35 ″ strip_html =« yes » hide_on_mobile = «малая видимость, средняя видимость, большая видимость» class = «» id = «» animation_type = «» animation_direction = «left» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ”” /] [fusion_separator style_type = ”single solid» top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” icon_circle_color = ”” width = ”” Alignment = ”center” class = ”” id = ”” /] [fusion_title size = ”3 ″ content_align =” center ”style_type =” none ”sep_color =” # ffffff ”margin_top =” 0px ”margin_bottom =” ”класс = ”” Id = ””] Свяжитесь с Black Fret [/ fusion_title] [fusion_text]
Эл. Почта:
[email protected]
Почту можно отправлять по адресу:
Black Fret
PO Box 29628
Austin, TX 78755
[/ fusion_text] [fusion_separator style_type = ”single solid” top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” icon_circle_color = ”” width = ”” alignment = ”Center” class = ”” id = ”” /] [fusion_title margin_top = ”10px” margin_bottom = ”5px” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” size = «3 ″ content_align =» center «style_type =» none «sep_color =» «]
Плейлист Black Fret
[/ fusion_title] [fusion_soundcloud url = ”https: // soundcloud.com / black-fret »layout =» visual »comments =» yes »show_related =« no »show_user =» yes »auto_play =« no »color =» # af0000 ″ width = «100%» height = «300 ″ hide_on_mobile = ”Малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” /] [/ fusion_builder_column] [fusion_builder_column type = ”1_1 ″ layout =” 1_1 ″ spacing = ”” center_content = ”no” link = ”” Target = ”_ self” min_height = ”” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая видимость” class = ”” id = ”” hover_type = ”none” border_size = ”0 ″ border_color =” ”border_style = ”Solid” border_position = ”all” border_radius = ”” box_shadow = ”no” Dimension_box_shadow = ”” box_shadow_blur = ”0 ″ box_shadow_spread =” 0 ″ box_shadow_color = ”” box_shadow_style = ”” padding_top = ”” padding_right = ”” ”Padding_left =” ”margin_top =” ”margin_bottom =” ”background_type =” single ”gradient_start_color =” ”gradient_end_color =” ”gradient_start_position =” 0 ″ gradient_end_position = ”100 ″ gradient_type =« linear »radial_direction =« center »linear_angle =” 180 ″ Background_color = ”” фон d_image = ”” background_image_id = ”” background_position = «left top» background_repeat = «no-repeat» background_blend_mode = »none» animation_type = »» animation_direction = «left» animation_speed = »0.3 ″ animation_offset = »» filter_type = «обычный» filter_hue = »0 ″ filter_saturation =» 100 ″ filter_brightness = »100 ″ filter_contrast =» 100 ″ filter_invert = »0 ″ filter_sepia =» 0 ″ filter_opacity = »100 ″ filter_blur =» 0 ″ Filter_hue_hover = »0 ″ filter_saturation_hover =» 100 ″ filter_brightness_hover = »100 ″ filter_contrast_hover =» 100 ″ filter_invert_hover = »0 ″ filter_sepia_hover =» 0 ″ filter_opacity_hover = »100 ″ fusion_black_hover =» 100 ″ fusion_black_hover [столбцы] = ”” Column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”” rule_color = ”” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” animation_type = ” «Animation_direction =» left «animation_speed =» 0.3 ″ animation_offset = ””]
В прошлом году некоммерческая организация Black Fret в Остине наградила 250 000 долларов местным музыкантам на пятом ежегодном балу Black Fret Ball в ACL Live в The Moody Theater. На шоу были представлены живые выступления 15 из 20 номинантов на грант на 2018 год. Среди получателей гранта, каждый из которых получил по 20 000 долларов, — Донован Кейт, Greyhounds, Los Coast, Джейн Эллен Брайант, Джейми Харрис, Wood & Wire, Джефф Планкенхорн, Исраэль Нэш, Shy Beast. и Томар и ФК. Среди получателей гранта в размере 5000 долларов — КГБ Техаса, Ребекка Лёбе, Дэйв Шер, Пало Дуро, Мегафауна, Гигантская собака, Проблемы на улицах, Билли Кинг и плохой плохой плохой, Отис-разрушитель и Калу и Electric Joint.
[/ fusion_text] [fusion_imageframe image_id = ”5708 | full” max_width = ”” style_type = ”bottomshadow” blur = »” stylecolor = ”” hover_type = ”liftup” Borderize = ”” bordercolor = ”” borderradius = ”” align = ”Center” lightbox = ”yes” gallery_id = ”” lightbox_image = ”” lightbox_image_id = ”” alt = ”Annual Black Fret Ball” link = ”” linktarget = ”_ self” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая- видимость ”класс =” ”id =” ”animation_type =” ”animation_direction =” left ”animation_speed =” 0.3 ″ animation_offset = ””] https: // blackfretorg.stage.site/wp-content/uploads/2019/11/annual-black-ball-image.jpg[/fusion_imageframe provided[fusion_text columns = ”” column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”» rule_color = ”” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая видимость” class = ”” id = ”” animation_type = ”” animation_direction = ”left” animation_speed = ”0.3 ″ animation_offset =” ”]
Фото с Black Fret Ball 2018
[/ fusion_text] [fusion_text columns = ”” column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”” rule_color = ”” hide_on_mobile = ”малая видимость, средняя видимость, большая видимость” class = » ”Id =” ”animation_type =” ”animation_direction =” left ”animation_speed =” 0.3 ″ animation_offset = ””]
О Black Fret:
Основанная в 2013 году, Black Fret — это общественная благотворительная организация со штаб-квартирой в Остине, миссия которой — дать музыкантам возможность создавать и исполнять новую музыку. Организация представляет собой новаторское развитие старой модели патронажа симфонических оркестров, ориентированной на поддержку популярной местной музыки. Вместе ограниченное членство Black Fret создаст благотворительную организацию, способную предоставлять гранты артистам Остина на сумму более 1 миллиона долларов в год.Ежегодные членские взносы Black Fret составляют 1500 долларов, а после уплаты налогов — примерно до 100 долларов в месяц. Многие участники имеют доступ к корпоративной программе благотворительных пожертвований (например, предлагаемой Dell, Apple и другими крупными работодателями), которая может снизить ежемесячные расходы до менее чем 50 долларов в месяц. В обмен на ежегодные взносы участники получают возможность участвовать в различных частных мероприятиях, включая ежемесячные шоу в уютных залах и невероятное ежегодное шоу наград под названием The Black Fret Ball. Получатели гранта выбираются ежегодно в течение года, когда участники, советники и предыдущие получатели грантов номинируют, лоббируют, смотрят выступления и, наконец, голосуют за своих любимых артистов.

Как установить динамики в задние двери автомобиля Лада Веста

Как сделать проставки под динамики своими руками

Самодельные подиумы для автомобильных динамиков

Из чего сделать проставки под динамики

Акустика в передние двери Лада Гранта

Подготовительные работы

Установка динамиков в передние двери Granta

Как поставить 16см колонки с проставками

Проставки под динамики на Калину

Шаблон под 16 динамики

Как изготовить проставочные кольца для динамиков

Смотрите также

Комментарии 22

Лада калина передние колонки

Выбираем аудиосистему

Размеры стандартных автомобильных динамиков

Мощность динамиков

Размер колонок

Установка динамиков в передние и задние двери

Что именно потребуется купить?

Разрезаем пластик электролобзиком

Выбор подходящих динамиков

Процесс монтажа акустических систем

Отзывы и рекомендации

Что именно потребуется купить?

Разрезаем пластик электролобзиком

Выбор подходящих динамиков

Процесс монтажа акустических систем

Отзывы и рекомендации

TOP15 Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Puller Cutter Ac String

Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Съемник Режущая струна Ac

Fancyes Guitar Luthier Tools Fret Hammer Съемник Режущая струна Ac

Измененные и новые списки PBS для автоинжекторов адреналина

Программы

Профессиональное образование

Популярные инструменты

Будьте в курсе новостей NPS MedicineWise

Нижний колонтитул

Потребители: поговорите со специалистом

ДНК-зондов с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET): конструкции и применения

Abstract

ВВЕДЕНИЕ

ТЕОРИЯ FRET

КОНСТРУКЦИИ И ПРИМЕНЕНИЕ ДНК FRET-ЗОНДОВ

Обнаружение гибридизации ДНК

Смежные зонды гибридизации

Молекулярные маяки

Двухцепочечные зонды гибридизации

Зонды для гибридизации в комбинации с интеркалятором

Мониторинг ПЦР

5′-нуклеазный анализ для ПЦР-мониторинга (зонды TaqMan)

Молекулярные маяки

Праймеры Scorpion

Обнаружение мутации ДНК

Анализ Invader

Удлинение праймера на основе матрицы

Обнаружение расщепления ДНК

Обнаружение лигирования ДНК

Обнаружение рекомбинации ДНК

Мониторинг синтеза РНК

Праймеры для секвенирования с переносом энергии

Биосенсоры на основе ДНК, использующие FRET

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

Engineering Dark Chromoprotein Reporter for Photoacoustic Microscopy and FRET Imaging

Общие методы

Очищенный белок и

Случайный мутагенез и подготовка планшета

Скрининг на основе поглощения

Строительство тандема Ультрамарин 7.2 димер

Характеристика белка

Фотоакустическая система

Обработка сигналов и изображений

Конструирование протеазного биосенсора для

Конструирование биосенсора каспазы-3 для визуализации живых клеток

Общие методы визуализации живых клеток

Визуализация апоптоза, индуцированного стауроспаурином

теперь будет достигаться в День благодарения каждый год

Вот 50 ваших любимых торговых сетей, которых больше нет.