R ₀ = [2,8 x 10 ¹⁷ × Κ ² × Q _{D D} × J (λ)] ^1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень совмещения определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может изменяться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Почти для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы отрегулировать это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, которые может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как другой канал будет доминировать с систематическим шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по взаимодействию белок-белок, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозного прохождения (также называемого перекрестными помехами и кроссовером ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора (, рис. 5 (а), ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора значительно перекрываются (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцепторное фотообесцвечивание

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и чтобы акцептор фотообесцвечивался примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но отличные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в . Рисунок 7 (a) — это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (примерно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивностях на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображения поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Основным достоинством этого подхода является простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал-шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов, имеющих числовую апертуру 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков (, рис. 8 (а), ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( рис. 8 (b), ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( рис. 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки могут использоваться для маркировки компонентов мембраны для изучения явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемый бета -ствол или бета -кан ) и состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. фиг.9, ).Концы цилиндра закрыты полускиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9, ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют по крайней мере ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков Aequorea может в некоторых случаях использоваться для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерной концентрации синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченых клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось о флуоресцентном белке, способном генерировать активные формы кислорода ( ROS, ) при освещении зеленым светом, как об эффективном агенте для инактивации определенных белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), таким образом заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. Таблица 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко отображены в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с CFP Aequorea и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP, названный CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ), был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные супер CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно было создано новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальным альтернативным партнером FRET, излучающим зеленый цвет, для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны обеспечивать кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1, ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и полезен при локализации слитых тегов, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным и демонстрирует разумную фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в ​​разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известный на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку цветовая палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение в экспериментах, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый свет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (под названием mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для изучения локализации и FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе — это тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов в локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красный mFruit белков, mApple , mCherry и mStrawberry (пики излучения на 592, 610 и 596 нанометрах соответственно), имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mpple и mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Самый потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубых, зеленых, желтых и оранжевых областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией и в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рис. 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум излучения 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое возбуждение акцептора. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему представляют собой наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов.В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов. Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом исследования взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты.Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале. Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Визуализация флуоресценции с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представленный в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на рис. , ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критически важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C oplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , созданный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием той же матрицы включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой бета -цепи в основной цепи флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, которые приводят к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансной передаче энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

E _FRET = 1 / [1 + (r / R ₀ ) ⁶ ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний меньше R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний больше R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рисунке 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET может эффективно использоваться в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или буферном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (a) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP (, рис. 5 (b), ) демонстрирует значительное перекрытие по интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, производимых в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

• Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
• Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенную эмиссию донора при фотообесцвечивании акцептора
• Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
• Спектральная визуализация — возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
• Флуоресцентная поляризационная визуализация — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно упоминается как двухцветная визуализация с элементами управления, сенсибилизированное излучение, пожалуй, самый простой метод визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереалистичном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для сенсибилизированной эмиссионной FRET-визуализации были разработаны различные корректирующие подходы. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-тестов сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцепторов с использованием визуализации живых клеток. Фиг. 6 (a) иллюстрирует эпителиальную клетку карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующую биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой обезьяны (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацелен на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (е) ) увеличивает расщепление донора (усиление зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно было создано новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальным альтернативным партнером FRET, излучающим зеленый цвет, для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны обеспечивать кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1, ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и полезен при локализации слитых тегов, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным и демонстрирует разумную фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в ​​разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известный на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку цветовая палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение в экспериментах, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый свет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (под названием mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для изучения локализации и FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе — это тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов в локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красный mFruit белков, mApple , mCherry и mStrawberry (пики излучения на 592, 610 и 596 нанометрах соответственно), имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mpple и mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Самый потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубых, зеленых, желтых и оранжевых областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией и в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рис. 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум излучения 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое возбуждение акцептора. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему представляют собой наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Скрининг белок-белковых взаимодействий с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) и микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM)

Анализ на основе FRET для быстрого определения антигена

Исследователи из Хельсинкского университета разработали новый экспресс-тест для обнаружения вирусных антигенов и применили его для диагностики инфекций SARS-CoV-2.Исследование, доказывающее жизнеспособность экспресс-теста, было опубликовано на этой неделе в mBio .

Тест основан на резонансном переносе энергии Фёрстера с временным разрешением (TR-FRET), который позволяет измерять вирусные частицы или собственные белки организма с помощью тестов смешивания и считывания сложных биологических образцов, таких как сыворотка или даже цельная кровь.

Новый экспресс-тест SARS-CoV-2 работает следующим образом: мазок из носоглотки, взятый у испытуемого, смешивается с тестовым раствором, который содержит антитела, распознающие нуклеопротеин SARS-CoV-2 или спайковый белок.Антитела, помеченные флуоресцентными метками, связываются с частицами SARS-CoV-2, образуя молекулярные сборки или комплексы, существование которых может быть подтверждено / обнаружено с помощью анализа TR-FRET. Результаты приходят примерно через 10 минут: образование каких-либо комплексов с высокой степенью достоверности демонстрирует инфекцию, вызванную SARS-CoV-2 у испытуемого.

По словам старшего автора Юсси Хепойоки: «В нашем исследовании мы продемонстрировали, что метод, основанный на феномене TR-FRET, может использоваться для диагностики инфекций SARS-CoV-2 на клинических образцах».

Hepojoki говорит, что еще одним преимуществом нового экспресс-теста, разработанного исследователями, является его безопасность для тестировщиков, поскольку вирус становится инактивированным вскоре после того, как он был добавлен в тестовый раствор.

В дополнение к новому коронавирусу принцип анализа может быть использован для обнаружения других респираторных инфекций или практически любой молекулы: единственное, что необходимо, — это антитело, способное идентифицировать целевую молекулу.

Универсальный, масштабируемый и быстрый анализ на основе TR-FRET для обнаружения антигена SARS-CoV-2

ВВЕДЕНИЕ

Продолжающаяся пандемия коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19) к декабрю 2020 года охватила почти полтора миллионов жизней во всем мире, с более чем 60 миллионами подтвержденных инфекций. Для лечения болезни ключевое значение имеют точные диагностические инструменты. Обнаружение возбудителя, тяжелого острого респираторного синдрома, коронавируса 2 (SARS-CoV-2) или его частей, является краеугольным камнем диагностики, поскольку проявления болезни часто неотличимы от других респираторных инфекций.Основой диагностики COVID-19 является тестирование RT-PCR, которое обычно проводится с помощью мазка из носоглотки (NPS), при этом также используются мазки из ротоглотки или средней носовой раковины, а также образцы слюны. В качестве альтернативы все чаще используются менее трудоемкие тесты на обнаружение антигенов. Тесты на антигены, как правило, специфичны, но аналитически менее чувствительны, чем ОТ-ПЦР. ОТ-ПЦР может обнаруживать вирусную нуклеиновую кислоту даже после того, как инфекционный вирус исчез, при этом индивидуум в это время вряд ли представляет риск передачи ^1-3 .Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что тестирование на антиген может лучше коррелировать с восстановлением инфекционного вируса, чем бинарная ОТ-ПЦР ⁴ . В качестве альтернативного подхода к снижению передачи SARS-CoV-2 ⁵ было предложено частое тестирование на антигены.

SARS-CoV-2 представляет собой оболочечный (+) ssRNA вирус рода Betacoronavirus семейства Coronaviridae из отряда Nidovirales . Он содержит четыре структурных белка: нуклеопротеин (NP) образует рибонуклеопротеидный комплекс с несегментированным вирусным геномом размером 30 т.п.н.Белки оболочки (E) и мембраны (M) встроены в оболочку, как и белок-шип (SP), выступающий из поверхности вириона и образующий большие выступы на поверхности, называемые короной. SP подвергается процессингу с образованием S1, который содержит рецептор-связывающий домен (RBD), первоначально прикрепляющий вирус к ангиотензин-превращающему ферменту-2 (ACE-2) на мембране клетки-хозяина, и S2, который опосредует слияние вирус-клетка. В ответ на пандемию доступны десятки коммерческих тестов на антиген SARS-CoV-2, преимущественно латерального потока или иммуноферментного типа.Наиболее целевой NP в качестве аналита ⁶ . Из семи тестов на антигены, получивших к декабрю 2020 года разрешение на экстренное использование (EUA) от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), шесть целевых N и один S ⁷ .

В течение последних нескольких лет мы активно использовали резонансный перенос энергии Фёрстера с временным разрешением (TR-FRET) в качестве основы для быстрого гомогенного иммуноанализа «смешай и считывай» для обнаружения антител ^8-14 . FRET возникает, когда донор и акцепторный флуорофор находятся в непосредственной близости, в результате чего возбужденный донор передает энергию акцептору, который затем излучает фотон с определенной длиной волны.Чем ближе донор и акцептор, тем чаще происходит передача энергии, при этом эффективность 50% обычно достигается на расстоянии от 15 до 60 Å. TR-FRET с активированным донором лантанида позволяет проводить измерения на автофлуоресцентных биологических образцах.

Здесь мы описываем быстрый метод на основе TR-FRET для обнаружения SARS-CoV-2 NP и SP. В анализе поликлональные кроличьи антитела против NP и против RBD, каждое из которых мечено донорным или акцепторным флуорофором, объединяют в эквимолярном соотношении и смешивают с клиническим образцом.Антиген, если он присутствует, связывает меченые антитела и сближает флуорофоры. Это приводит к сигналу TR-FRET при возбуждении, указывающем на присутствие антигена. Сначала мы демонстрируем пределы обнаружения рекомбинантных NP и SP, а также SARS-CoV-2, выращенного на клеточной культуре. Затем мы оцениваем эффективность анализа среди 48 положительных при ОТ-ПЦР и 96 отрицательных клинических образцов НПВ и сравниваем результаты обнаружения антигена с результатами ОТ-ПЦР и культивирования вирусов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы пациентов и контрольные результаты

Оценка TR-FRET-анализа SARS-CoV-2 проводилась с использованием образцов мазков из носоглотки (NPS), собранных в физиологическом растворе.Образцы были взяты у пациентов с клиническим подозрением на COVID-19, и первоначально они были отправлены в Диагностический центр HUS, HUSLAB для тестирования SARS-CoV-2 RT-PCR. Затем образцы хранили при -20 ° C.

ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 был основан на лабораторном тесте (LDT). Детали и выполнение теста в нашей лаборатории были описаны ранее ¹⁵ . В этом методе (на основе N-гена, модифицированного из Corman et al. ¹⁶ ) образцы были инактивированы путем объединения 250 мкл буфера для лизиса / связывания MagNA Pure (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и 250 мкл буфера для лизиса / связывания. образец.Экстракцию нуклеиновой кислоты проводили из 450 мкл лизата образца с помощью набора MagNA Pure Viral NA SV 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). ОТ-ПЦР выполняли с использованием набора SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit с 600 нМ прямого праймера CACATTGGCACCCGCAATC, 800 нМ обратного праймера GAGGAACGAGAAGAGGCTTG и 200 нМ зонда FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BBQQ.

Положительная панель ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 включала 48 образцов со значениями порога цикла (Ct), находящимися в линейном диапазоне от 11.42 и 29,98 в LDT. Панель с отрицательными результатами ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 включала 96 образцов, отрицательных по результатам LDT. Данные пациентов были собраны, а образцы обработаны в соответствии с разрешением на исследования, утвержденным местным наблюдательным советом, разрешение HUS / 32/2018 (Университетская больница Хельсинки, Финляндия).

Клеточные линии, выделение и размножение вируса

Клетки Vero E6 трансдуцировали лентивирусным вектором, экспрессирующим трансмембранную сериновую протеазу 2 человека, TMPRSS2, кДНК варианта транскрипта 2 (NM_005656.4) и в качестве селективного маркера бластицидин.В частности, 1 мл отфильтрованного 0,22 мкм (Millipore) инфекционного супернатанта клеток HEK293T, трансфицированных на 10-см планшете за 48 часов до этого, с использованием 30 мкг полиэтиленимина с 5 мкг pLenti6.3 / V5-DEST TMPRSS2 (получено из Biomedicum Functional Genomics Unit, University из Хельсинки) и 5 ​​мкг p8.9NDSB ¹⁷ плюс 2-5 мкг pMD2.G (подарок от Дидье Троно, плазмида Addgene № 12259; https://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259) добавляли к клеткам Vero E6, засеянным на 6-луночные планшеты. После 2 дней отбора с 15 мкг / мл Blasticidin S HCl (Invitrogen) клеткам давали возможность разрастаться до слияния и трижды пересевали.После подтверждения отрицательного результата на р24 получали клональную популяцию клеток Vero E6-TMPRSS2 путем ограничивающего разведения. Полученные клоны (N = 5) анализировали на экспрессию TMPRSS2 иммуноблоттингом с антителом V5 (Invitrogen). Клон, экспрессирующий наибольшее количество TMPRSS2, VE6-TMPRSS2-h20, был выбран для использования.

Выделение SARS-CoV-2 из клинических образцов (хранящихся при -20 ° C со дня сбора, не подвергшихся замораживанию-оттаиванию) было предпринято как на клетках Vero E6, так и на клетках VE6-TMPRSS2-h20.Обе клеточные линии культивировали в Minimal Essential Medium Eagle (MEM, Sigma) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco), 100 МЕ пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Sigma) и 2 мМ L-глутамина (Sigma). . Для выделения клетки выращивали на 12-луночных планшетах примерно до 90% конфлюэнтности, ростовую среду заменяли 400 мкл MEM-2% (как указано выше, но с 2% FBS) с последующим добавлением 50 мкл образца NPS. (в условиях уровня биобезопасности 3) и инкубация в течение 1 часа при 37 ° C, 5% CO ₂ .После двух промывок MEM-2% культуры хранили в 1 мл свежего MEM-2% в течение 4 дней при 37 ° C (5% CO ₂ ), среду собирали и осветляли центрифугированием (3000 x rcf, 5 мин. ), и клетки фиксировали в течение 15 мин при комнатной температуре 3,7% формальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) с последующей промывкой PBS и УФ-инактивацией (5000 x100 мДж, УФ-сшивающий агент, CL-1000, Jena Analytik). Фиксированные клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым, и степень цитопатического эффекта (CPE) оценивалась от 0 до 3 (от ненаблюдаемой до обширной гибели клеток).Для подтверждения инфекции РНК экстрагировали (набор для экстракции вирусной РНК QIAgen QIAamp, следуя протоколу производителя) из 100 мкл супернатанта каждой клеточной культуры, и наличие или отсутствие SARS-CoV-2 анализировали с помощью ОТ-ПЦР, нацеленной на RdRp (РНК- зависимой РНК-полимеразы), как описано ¹⁶ .

Для экспериментов по обнаружению антигена TR-FRET мы произвели запас SARS-CoV-2 в клетках Vero E6 ¹⁸ . Вкратце, 90-95% конфлюэнтных клеток Vero E6 инокулировали 500 мкл супернатанта, разведенного 1: 100, содержащего SARS-CoV-2 (пассаж 7, приблизительно 5 × 10 ⁷ инфекционная доза культуры ткани 50, TCID50, на мл).Через 1 час адсорбции вируса среду заменяли MEM-2%, а через 2 дня при 37 ° C 5% CO2 супернатант собирали и осветляли центрифугированием (3000 x rcf, 5 минут) и хранили в аликвотах при −80 ° С. УФ-инактивацию супернатантов культур проводили, как описано выше.

Коронавирус человека 229E (hCoV-229E, любезно предоставлен доктором Сиско Тауриайнен, Университет Турку, Турку, Финляндия) и NL63 (hCoV-NL63, любезно предоставлен Лией ван дер Хук, Академический медицинский центр, Амстердам, Нидерланды). в качестве контроля для оценки перекрестной реактивности анализа.Исходный материал hCoV-229E получали путем инокуляции клеток почек макака-резуса, LLC-MK2 (от ATCC), с 500 мкл супернатанта культуры клеток, разведенного 1: 1000 (приблизительно 5 × 10 ⁹ TCID50 / мл) в течение 1 часа при 37 ° С. C 5% CO2. После адсорбции вируса среду заменяли на MEM-2%, клетки выращивали в течение 5 дней (37 ° C, 5% CO2), супернатант собирали, центрифугировали (3000 x rcf, 5 мин) и хранили в аликвотах при — 80 ° С. Исходный материал hCoV-NL63 получали инокуляцией фибробластов легких человека (MRC-5, от ATCC) 500 мкл супернатантов клеточных культур, разведенных 1: 100 (приблизительно 1 × 10 ⁶ TCID50 / мл) в течение 1 ч при 37 ° C. 5% CO2.После адсорбции вируса среду заменяли на MEM-2%, клетки выращивали в течение 7 дней (до появления дефинитивного CPE), супернатанты собирали, центрифугировали (3000 x rcf, 5 мин) и хранили в аликвотах при -80 ° C. Супернатанты hCoV-229E и hCoV-NL63 были инактивированы для экспериментов путем смешивания в соотношении 1:10 в буфере RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% дезоксихолат натрия. и Roche cOmplete коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА).

Антигены и антитела

Производство и очистка антигенов SARS-CoV-2 NP и SP осуществлялась согласно описанному протоколу ^14,19,20 .RBD SP продуцировали в клетках Expi293F, как описано ^19,20 . Кроличьи антисыворотки против RBD и NP были созданы в BioGenes GmbH (Берлин, Германия): начальная доза на 0-й день 150 мкг, на 7-й день бустера 75 мкг, на 14-й день бустер 75 мкг, на 28 день бустер 150 мкг и на 42 день окончательное кровотечение. Для аффинной очистки RBD и NP были связаны с CNBr-сефарозой 4B (Cytiva) в соответствии с протоколом производителя. Соответствующие антисыворотки пропускали через связанные сефарозы, упакованные в хроматографические колонки Poly-Prep (Bio-Rad), промывали 20 объемами колонки фосфатно-солевым буфером (PBS), элюировали (0.1 M глицин, 150 мМ NaCl, pH 2,5) с 2 M Tris, pH 9,0, концентрировали с использованием центробежного фильтра Amicon Ultra 15 мл 100 кДа-NMWL (Millipore / Merck) и диализовали против PBS с использованием кассет для диализа Slide-A-Lyzer ( Thermo Scientific).

Маркировка

Мы пометили аффинно очищенные антитела, 250 мкг / реакцию, донором (европий, Eu) и акцептором (Alexa Fluor 647, AF647), соответственно, с помощью набора для маркировки хелатных белков QuickAllAssay Eu (BN Products and Services Oy) и Alexa Fluor ™ 647 NHS Ester (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.Одноразовая колонка для обессоливания PD-10 со смолой Sephadex G-25 (Cytiva), служащая для удаления непрореагировавших флуорофоров, и центробежный фильтр Amicon Ultra 0,5 мл 50 кДа-NMWL (Millipore / Merck) для концентрирования меченых антител, которые затем хранились в виде аликвот. при -80 ° C до использования.

Анализы TR-FRET

Сначала мы настроили анализы TR-FRET для антигенов SARS-CoV-2 SP и NP, используя соответствующие очищенные белки, а также соответствующие меченные Eu и AF анти-RBD и антигены. -NP антитела.Принцип анализа и рабочий процесс изображены на фиг. 1. Вкратце, смеси антител с эквимолярными концентрациями меченных Eu и AF концентраций антител против RBD и антител против NP готовили в буфере RIPA. Для настройки анализа пул из четырех образцов НПВ, отрицательных по SARS-CoV-2, был разделен на аликвоты и дополнен белками NP или SP в различных концентрациях. 10 мкл смеси антител вносили пипеткой в ​​384-луночный микропланшет (ProxiPlate 384 Plus F, Black 384-мелколуночный микропланшет, PerkinElmer, США), а затем 10 мкл образца с добавленным антигеном.Сигнал TR-FRET измеряли непосредственно после этого и в моменты времени 7, 15, 22, 30, 45, 60 и 90 минут после первого измерения с помощью считывающего устройства для микропланшетов Hidex Sense (Hidex Oy, Финляндия). Возбуждение донора FRET осуществляли при 330 нм, и после задержки в 70 мкс сигналы донора и акцептора измеряли в течение 100 мкс при 616 и 665 нм, соответственно. Сигналы TR-FRET выражали в виде отношений HTRF, рассчитанных следующим образом: отношение HTRF = излучение при 616 нм / излучение при 665 нм x 10000. После этого отношения HTRF, измеренные для образцов с добавленным антигеном, сравнивали с значениями, измеренными для образцов, не содержащих антиген. образец с добавлением добавок в том же цикле, чтобы рассчитать кратное увеличение отношения HTRF.Концентрации антител в планшете от 5 до 500 нМ (половина Eu- и половина AF-меченные) подвергали перекрестному титрованию с концентрациями антигена в планшете от 5 до 500 нМ.

Рабочий процесс и принцип анализа TR-FRET. Слева показаны компоненты реакции. В центре находится лунка, содержащая меченные донором и акцептором антитела в молярном соотношении 1: 1 в реакционном буфере, в нашей установке общая концентрация антител в этот момент составляет 24 нМ, а объем — 10 мкл. Стрелки указывают на добавление материала образца в нашей установке либо 10 мкл очищенного рекомбинантного белка, либо 10 мкл образца NPS.В правом верхнем углу схематически показаны комплексы антиген-антитело, образованные после добавления образца, содержащего антиген, реакционный объем на этом этапе в нашей установке составляет 10 мкл. Правая нижняя сторона схематически демонстрирует, что меченые антитела не образуют активных комплексов TR-FRET в отсутствие антигена.

Затем оценивали диапазоны концентраций антигена, определяемые с помощью TR-FRET (при концентрациях меченных Eu и AF анти-NP / -RBD 6 + 6 нМ), выполняя анализ, как описано выше, с использованием концентраций N и S на чашках От 5 фМ до 5 нМ.

Для оценки эффективности анализа с образцами, содержащими вирионы, использовали супернатанты клеточных культур, содержащие примерно 10 ⁷ TCID50 / мл SARS-CoV-2. Для начальных экспериментов (проведенных в лаборатории BSL-3) использовали супернатант культуры инфекционных клеток (неразбавленный, 1:10, 1:25, 1:50 и 1: 100, разведенный в RIPA). После проверки того, что УФ-инактивированный вирус дает аналогичные результаты, в матрицу отрицательного NPS-образца добавляли УФ-инактивированный вирус, содержащий супернатант клеточной культуры, с получением серии разведений от 1:10 до 1: 20480.Образцы тестировали в анализах TR-FRET, проводимых, как указано выше, при концентрациях меченных Eu и AF антител к NP / -RBD 6 + 6 нМ.

Анализ образца NPS выполняли путем смешивания 10 мкл образца с 10 мкл смесей антител (концентрации меченных Eu и AF анти-NP / -RBD составляли 6 + 6 нМ). Анализы TR-FRET с использованием SARS-CoV-2 RT-PCR-положительных образцов НПВ проводились в лаборатории BSL-3, а отрицательные RT-PCR — в лаборатории BSL-2. Сигналы, продуцируемые hCoV-229E и hCoV-NL63, оценивали путем смешивания 10 мкл (неразбавленного, 1:10, 1:25, 1:50 и 1: 100, разведенного в RIPA) супернатанта клеточной культуры с 10 мкл смеси антител (при концентрациях меченных Eu и AF анти-NP / -RBD 6 + 6 нМ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Подтверждение концепции для анализа гомогенного определения антигена

Мы предположили, что гомогенное, то есть в растворе, обнаружение антигенов может быть достигнуто с использованием поликлональных антител, отдельно меченных флуорофорами, образующими пару FRET. Чтобы проверить гипотезу и принцип анализа, представленные на рис. 1, мы создали антисыворотку против SARS-CoV-2 NP и RBD SP, титры> 204 800 на основе NP и SP ELISA соответственно. После аффинной очистки антитела метили хелатным европием (Eu, донор) и AlexaFluor 647 (AF647, акцептор).В первых экспериментах мы проверили принцип анализа, смешивая рекомбинантные NP и SP с 1 мкМ (500 нМ меченых Eu + 500 нМ AF647) смесей антител против NP и RBD в присутствии увеличивающегося количества бычьего сывороточного альбумина (BSA ) концентрации. Добавление BSA увеличивало отношение сигнал / шум, побуждая нас оценивать характеристики анализа с дальнейшим использованием надосадочных жидкостей клеточных культур, содержащих инфекционный SARS-CoV-2, и различных буферных составов. Анализ с концентрацией антител 1 мкМ дал приличное отношение сигнал / шум в буфере RIPA (анализ радиоиммунопреципитации), содержащем детергент (рис.S1). Используемый здесь буфер RIPA (полный рецепт см. В материалах и методах) содержал 1% NP-40 и 0,1% SDS, которые, как было показано, эффективно инактивируют SARS-CoV-2 ^21,22 в оболочке, поэтому мы должны использовать RIPA для последующих анализов.

Оптимизация анализа с использованием рекомбинантных антигенов и SARS-CoV-2

Для оптимизации результатов анализа мы смешали меченые антитела в эквимолярном соотношении с известными количествами рекомбинантных NP и SP и записали полученные сигналы TR-FRET (как HTRF, однородная флуоресценция с временным разрешением, значения) как функция времени.Результаты показали, что анализы дают самые высокие значения HTRF, когда концентрация меченых антител равна концентрациям очищенных соответствующих антигенов (рис. S2). Более высокие концентрации антител сокращают время, необходимое для достижения пика сигнала (кратное увеличение значения HTRF, HTRF _{образец} / HTRF _буфер ): при концентрации антитела 5 нМ (2,5 нМ Eu- + 2,5 нМ AF647-меченного) для достижения пика сигнала как для NP, так и для SP требуется ~ 60 минут, тогда как при концентрации антитела 500 нМ пик сигнала NP наступает через 7 минут, а пик сигнала SP достигается за ~ 30 минут.Мы также проверили характеристики анализа с Eu- и AF-меченными антителами, смешанными в неравных пропорциях 1: 2 и 2: 1, но это не увеличило отношение сигнала к фону (Таблица S1).

Затем мы оценили эффективность анализа при общих концентрациях антител 50, 25, 12 и 6 нМ с использованием супернатантов клеточных культур, содержащих SARS-CoV-2, в различных разведениях. Мы включили УФ-инактивированный супернатант клеточной культуры, чтобы выяснить, повлияет ли УФ-инактивация на анализ. Результаты совпали с результатами, полученными с использованием рекомбинантных антигенов, и показали зависимость кинетики сигнала TR-FRET от концентрации антигена (рис.S3). Результаты также показали, что общая концентрация антител 12 нМ позволяет измерять антигены в широком диапазоне концентраций вирусов, и что инфекционный и УФ-инактивированный SARS-CoV-2 дает аналогичные результаты.

Пределы обнаружения

Чтобы оценить пределы обнаружения (LOD) для анализов при общей концентрации антител 12 нМ, мы добавили в пул образцов NPS либо очищенные антигены, либо инактивированный SARS-CoV-2 в различных разведениях. Для очищенных антигенов самые низкие концентрации, дающие легко обнаруживаемые сигналы, были равны 0.05 нМ для NP и 0,5 нМ для SP (рис. S4, a-b). С УФ-инактивированным SARS-CoV-2 разведения супернатанта до 1: 5120 и 1: 160 давали надежно измеряемые сигналы с антителами против NP и против RBD, соответственно (рис. S4, c-d). При объеме образца 10 мкл предел обнаружения анализа для рекомбинантных NP составлял ~ 25 пг (с использованием молекулярной массы 50 кДа) и 875 пг для SP (с использованием молекулярной массы 175 кДа). Соответственно, анализ NP может выявить примерно 15, а анализ RBD — примерно 420 бляшкообразующих единиц (преобразованных с использованием 0.7 x TCID50 / мл = БОЕ / мл) на реакцию.

Обнаружение антигенов SARS-CoV-2 в образцах НПВ

После настройки условий анализа с использованием рекомбинантных белков и вируса, выращенного на культуре клеток, мы протестировали тесты на обнаружение вирусного антигена в НПВ, положительных при ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 образцы. У нас было 48 образцов НПВ со значениями порога цикла ОТ-ПЦР (Ct) в линейном диапазоне от ~ 12 до 30 (рис. S5), и использовали общие концентрации антител 50, 25, 12 и 6 нМ. Мы наблюдали, что образцы со значениями Ct ≤25 давали сигнал в анализе NP (рис.S6). При использовании оптимизированных условий с общим количеством меченых антител 12 нМ чувствительность анализа NP TR-FRET по сравнению с RT-PCR составила 77,1% (37/48). Анализ SP показал большее разнообразие; большинство образцов со значениями Ct ≤15 дали положительный результат (рис. S6). Мы также провели иммуноблоттинг для обнаружения NP и SP в образцах NPS, охватывающих диапазон значений Ct от 12,8 до 26,2, и смогли обнаружить SP и NP в образцах со значением Ct <22 (рис. S7).

Связь между инфекционным вирусом и обнаружением антигена

Чтобы определить, в какой степени антигенные анализы соответствуют количеству инфекционного вируса в образце, мы подвергли 48 SARS-CoV-2 RT-PCR-положительных НПВ вирусам.Сообщалось, что трансмембранная сериновая протеаза 2 (TMPRSS2) действует при праймировании пика SARS-CoV-2 для входа ²³ , и поэтому мы выбрали использование как дикого типа, так и клональной популяции экспрессирующих TMPRSS2 (VE6-TMPRSS2-h20). ) Vero E6 клетки (рис. S8). Как показали цитопатические эффекты, а также ОТ-ПЦР из супернатантов клеточных культур, SARS-CoV-2 был выделен из 35/48 и 38/48 образцов NPS с клетками Vero E6 и VE6-TMPRSS2-h20 соответственно. Интересно, что супернатанты клеточных культур от клеток VE6-TMPRSS2-h20 дали положительный результат на 3-5 циклов раньше, чем супернатанты от клеток Vero E6, что указывает на эффективность продукции вируса в ~ 10-40 раз (рис.S9). В целом инфекционный SARS-CoV-2 был выделен из всех образцов, показывающих значения Ct ≤24,5. Затем мы сравнили анализ антигена с выделением вируса из соответствующих образцов и наблюдали, что все образцы со значениями Ct ≤24,5 оказались положительными в анализе NP (рис. 2а). Из образцов со значениями Ct> 24,5 все дали отрицательный результат в анализе TR-FRET NP, а SARS-CoV-2 был восстановлен только из одного (Ct 24,87). При использовании оптимизированных условий с общим количеством меченых антител 12 нМ чувствительность анализа NP по сравнению с выделением вируса составила 97.4% (37/38). Производительность теста SP была хуже; только 8/38 образцов с восстанавливаемым SARS-CoV-2 дали положительный результат (рис. 2b).

Сравнение обнаружения антигена на основе TR-FRET и количества вируса, проанализированного с помощью ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 и выделения вируса из образцов НПВ. Общая концентрация антител в анализах составляет 12 нМ (6 нМ Eu- и 6 нМ антитела, меченного AF647). а) Результаты анализа против NP. б) Результаты анализа анти-RBD. Ось Y (логарифмическая шкала) показывает кратное увеличение отношения HTRF (HTRF _{, образец} / HTRF _буфер ), измеренное непосредственно после пипетирования образцов на планшете.По оси абсцисс показано значение Ct, измеренное в диагностической ОТ-ПЦР SARS-CoV-2. Горизонтальная черная линия представляет собой границу положительного результата теста на антиген, соответствующую среднему значению плюс четыре стандартных отклонения сигналов, индуцированных отрицательными образцами ОТ-ПЦР SARS-CoV-2. Вертикальная черная линия разделяет образцы НПВ с положительной (n = 48) и отрицательной (n = 96) ОТ-ПЦР SARS-CoV-2. Цвет на графиках указывает на наличие (красный) или отсутствие (синий) цитопатического эффекта (ЦПЭ) после инокуляции клеток VE6-TMPRSS2-h20 50 мкл образца NPS, черный = не культивированный.TR-FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера с временным разрешением, NP = нуклеопротеин, RBD = рецептор-связывающий домен, HTRF = гомогенная флуоресценция с временным разрешением.

Ложноположительная реакция и перекрестная реактивность

После того, как общая концентрация антител в 12 нМ была идеальной для проведения анализа, нам было интересно узнать частоту ложноположительных результатов. С этой целью мы протестировали в тестах на антиген TR-FRET 96 SARS-CoV-2 ОТ-ПЦР-отрицательных образцов НПВ. Параллельно мы изучали потенциальную перекрестную реактивность выращенных на культуре клеток сезонных коронавирусов простуды hCoV-229E и hCoV-NL63 в анализах TR-FRET.Среди образцов NPS с отрицательными результатами ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 только один дал положительный сигнал HTRF. Мы повторно проанализировали этот образец с помощью другого анализа RT-PCR (Xpert Xpress SARS-CoV-2, Cepheid), подтвердив отрицательный результат. Чтобы оценить антиген-специфичность сигнала, мы также проанализировали этот образец, используя несовпадающие комбинации меченых антител против NP и против RBD. Все комбинации дали положительный результат, что свидетельствует о том, что меченые антитела связывают не только антигены, но и нечто иное.При использовании оптимизированных условий с общим количеством меченых антител 12 нМ специфичность анализов NP и SP TR-FRET по сравнению с RT-PCR составила 99,0% (95/96), а по сравнению с выделением вируса — 100% (10/10). Затем мы установили в качестве пороговых значений для анализов TR-FRET среднее значение плюс четыре стандартных отклонения сигналов от SARS-CoV-2 RT-PCR отрицательных образцов NPS (за исключением одного выброса). При использовании этих пороговых значений ни hCoV-229E, ни hCoV-NL63 не давали значимого сигнала TR-FRET в анализе NP или SP (рис.3). Результаты со значениями отсечения, выбранными с использованием отрицательных образцов NPS, совпадали с результатами произвольных отсечений, использованных ранее, и суммированы на рис. 2.

SARS-CoV-2 TR-FRET на антиген, оцененный с помощью супернатанты культур клеток сезонных коронавирусов человека hCoV-229E и -NL63. a) Результаты анализа анти-NP с супернатантами культур клеток HCoV-229E и -NL63 при различных разведениях. б) Результаты анализа анти-NP с супернатантами культур клеток HCoV-229E и -NL63 при различных разведениях.Ось Y (логарифмическая шкала) показывает кратное увеличение отношения HTRF (образец HTRF _{/ буфер} HTRF _{). Горизонтальные линии указывают соответствующие пороговые значения анализа TR-FRET. УФ-инактивированный SARS-CoV-2, содержащий супернатант клеточной культуры, включен в качестве положительного контроля.}

ОБСУЖДЕНИЕ

Эпидемия SARS-CoV-2, начавшаяся в Китае в конце 2019 года, быстро переросла в пандемию весной 2020 года. После первоначального отставания в наращивании возможностей тестирования ОТ-ПЦР быстро стала золотым стандартом острой атипичной пневмонии. -CoV-2 диагностика.Хотя ОТ-ПЦР очень чувствительна к выявлению людей с острой инфекцией, недостатком является то, что пациенты, выздоравливающие от COVID-19, могут оставаться положительными на ОТ-ПЦР в течение длительного периода. С другой стороны, тестирование на антигены несколько менее чувствительно для выявления пациентов с острой инфекцией; тем не менее, похоже, что существует лучшая корреляция между присутствием антигена и инфекционного вируса в образцах NPS. В этой рукописи мы описываем разработанный в лаборатории тест для обнаружения антигена SARS-CoV-2 в образцах НПВ и сравниваем его эффективность с выделением вируса и ОТ-ПЦР.Анализ является быстрым и очень простым в использовании, кроме того, анализ довольно несложен в настройке при условии, что доступны специфические антитела против структурных белков вируса. Хотя мы используем в анализе поликлональные антитела, его, вероятно, можно было бы настроить с помощью моноклональных антител. Флуорофоры (хелатный Eu и AlexaFluor 647) легко доступны, и результаты можно прочитать на любом считывающем устройстве для микропланшетов, способном измерять флуоресценцию с временным разрешением. Примечательно, что мы настроили анализ в содержащем детергент буфере RIPA, который содержит 1% NP-40 и 0.1% SDS, оба из которых инактивируют SARS-CoV-2 ^21,22 . Таким образом, сбор образцов НПВ непосредственно в эту матрицу значительно повысил бы безопасность конечного пользователя.

Мы настроили анализ для обнаружения как NP, так и SP SARS-CoV-2, но наблюдали четкую разницу между LOD в двух анализах с NP, обнаруживаемым примерно в 35 раз более низкой концентрации. Вероятно, это объясняется тем, что мы использовали антитело, направленное против RBD, которое составляет лишь около одной шестой SP.Тот факт, что используемое антитело распознает только один домен, может сделать стерически невозможным для двух молекул антитела связывание одной молекулы SP, и поэтому мы предполагаем, что полученный сигнал исходит от тримеров SP, то есть шипов. NP более многочисленны как в вирионах, так и в инфицированных клетках (см. Рис. S7), что дополнительно способствовало более высокой чувствительности обнаружения NP в супернатантах клеточных культур и образцах NPS.

Анализ эффективности анализа антигена с использованием образцов NPS от 48 SARS-CoV-2 RT-PCR-положительных и 96 отрицательных лиц показал, что анализ NP правильно идентифицировал 37 положительных образцов и все отрицательные образцы, кроме одного.Все 37 истинно положительных результатов имели значение Ct <25 циклов диагностической ОТ-ПЦР. Как и в других исследованиях, мы наблюдали сильную связь между инфекционностью образца и положительным результатом теста на антиген; из 38 образцов, которые дали изолят 37, дали положительный результат в анализе NP. Мы использовали 50 мкл для выделения вируса, в то время как для анализа антигена требуется только 10 мкл, что может объяснить, почему один из образцов с инфекционным вирусом не был взят. Мы намеренно выбрали образцы NPS в широком диапазоне значений Ct в ОТ-ПЦР SARS-CoV-2, чтобы получить оценку предела обнаружения по сравнению с ОТ-ПЦР.Тот факт, что мы проанализировали образцы, которые не были собраны в свежем виде и были подвергнуты по крайней мере одному циклу замораживания-оттаивания, мог отрицательно повлиять на чувствительность анализа. В любом случае наш тест смог обнаружить 97,4% образцов NPS с инфекционным вирусом.

Поскольку анализы антигенов NP и SP дали положительный результат для одного отрицательного образца ОТ-ПЦР SARS-CoV-2, мы повторно проанализировали его с помощью другой ОТ-ПЦР с отрицательным результатом. Мы также попытались выделить вирус из образца, но безуспешно.Не исключено, что ложноположительный результат является результатом перекрестной реактивности на человеческий коронавирус, hCoV, инфекцию. Из hCoV только hCoV-NL63 и SARS-CoV используют тот же рецептор, что и SARS-CoV-2, то есть ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) ^24,25 . Таким образом, было бы наиболее логично, что реактивность этого образца будет обусловлена ​​hCoV-NL63, поскольку анализы SP (на основе RBD) и NP дали положительный результат. Тем не менее, мы протестировали два анализа с использованием hCoV-229E и hCoV-NL63, выращенных в культуре клеток, но с отрицательными результатами.Похоже, что образец, дающий ложноположительную реакцию, содержал мешающее вещество, которое вызывало агрегацию иммуноглобулинов, потому что также меченые антитела против различных антигенов давали сигнал TR-FRET. Использование антител с несовпадением может в будущем служить для различения истинных и ложноположительных результатов в анализе TR-FRET.

В заключение мы сообщаем о разработке быстрого теста на антиген SARS-CoV-2, основанного на одновременном связывании двух или более молекул антител, меченных флуорофором, с антигеном.Тест на антиген на основе TR-FRET выполняется быстро, и его результаты хорошо коррелируют с наличием инфекционного вируса в клинической пробе. Анализ легко настроить, если доступны подходящие антитела против SARS-CoV-2 NP и планшет-ридер, позволяющий измерять TR-FRET. По нашим оценкам, один считыватель планшетов и опытный техник могут вручную анализировать сотни образцов в час, в идеале с 30-минутным временем обработки от прибытия образца до получения результатов (подробности см.

Author: alexxlab