Схема простой сигнализации: СИГНАЛИЗАЦИЯ СВОИМИ РУКАМИ

Содержание

СИГНАЛИЗАЦИЯ СВОИМИ РУКАМИ

Сейчас микроконтроллеры отвлекли на себя значительный сектор внимания радиолюбителей, но не весь. Да и не может даже очень универсальное устройство охватить все случаи и ниши нашей жизни. А, между тем, и до сих пор служат устройства из прошлого века. И неплохо, что надо отметить, некоторые служат. Ну и определённые сложности с приобретением деталей, пайкой современных комплектующих, программированием, оборудованием и ПО для составления программ и прошивкой их в микроконтроллеры, знанием протоколов, списков ошибок, наличием всей документации и прочее. А тут есть старые надёжные и знакомые способы и, к тому же, ещё есть большие запасы старых запчастей, которые можно не отдавать за бесценок на драгметаллы, а использовать  с гораздо большей пользой.

Схема охранной сигнализации

Предлагаемая схема сигнализации основана на принципах прошлого века, но служат они, наряду с более современными и по сей день. Ведь они не требуют дорогих технологических устройств для своего ремонта и обслуживания, а потому поддерживаются, относительно дёшево, в рабочем состоянии по сей день.

Схема годится для охраны небольшого склада, гаража, дачи, частного дома и т.п. В схеме используется старый добрый шлейф – это подводной двужильный провод («лапша»):

Кабель ТРП. ТРП 2-0,4; ТРП 2-0,5 (ТУ16.КО4.005-89) — однопарные телефонные распределительные кабеля с медными жилами с полиэтиленовой изоляцией.

Кабель ПРППМ. ПРППМ 2-0,8; ПРППМ 2-0,9; ПРППМ 2-1,2 (ТУ У 05758730.009-98) — кабели телефонной связи и радиофикации. Провод ПРППМ типа предназначен для эксплуатации при напряжении 380 В частотой до 10 кГц на линиях телефонной связи и распределительных сетях. На параллельно уложенные две изолированные полиэтиленом медные жилы провода ПРППМ наложена оболочка из полиэтилена.

   

И включённые в последовательную цепь датчики разрыва (герконы, конечники, фольга, тонкий провод…), и датчики удара (виброконтактные, магнито-герконовые, инерционные…).

Датчик инерционный магнитоконтактный ДИМК предназначен для блокировки различных конструкций охраняемых объектов:

  • остекленных конструкций на разрушение стеклянного полотна;
  • на попытку разрушения стеклянного полотна при воздействии на контролируемую площадь удара с энергией, соответствующей 2/3 от энергии, разрушающую контролируемую площадь;
  • на попытку съема стеклянного полотна из крепежной конструкции;
  • на попытку съема оконных рам с выдачей сигнала «Тревога» на приемно-контрольный прибор, концентратор или пульт централизованного наблюдения.

СМК-4Э

  • Магнитно-контактный извещатель.
  • Подключение: проводное, NC контакты.
  • Накладной. Под деревянную/пластиковую дверь.
  • Зазор тревоги: 10 мм.

Принцип действия схемы

Сигнализация является пугающе-предупредительной световым и звуковым сигналом. Работает она, вкратце, так:

При попытках взлома, ударах, сотрясениях, вибрациях полов, стёкол, дверей, стен  и т.п. срабатывают «ударные» вибродатчики. Они на очень короткое время (миллисекунды) разрывают цепь шлейфа на что схема реагирует мгновенным и кратковременным (около 20 сек.) отпугивающим сигналом. Действие этого сигнала будет продолжаться пока не прекратятся удары или действия, воздействующие на «ударные» вибродатчики. 

Если же произошёл взлом, то сигнализация будет гудеть без остановки периодично отключая и подключая сигнал (с периодичностью прибл. 20 сек вкл. и 20 сек. откл.).

При отпирании двери без взлома срабатывает конечник или геркон и схема запоминает это, она даёт от 20-ти до 40-ка секунд (регулируется пользователем сигнализации) на то, чтобы дойти до потайной кнопки и квитировать или вовсе отключить сигнализацию.

Если квитации или отключения не произошло, то схема будет подавать сигнал как при взломе.

Например, на доме можно установить датчик отпирания входной двери (магнито-герконовый или конечник), в случае возможных попыток взлома вмонтировать тонкий провод в места возможных повреждений двери, или установить «ударный» датчик, чтобы до поломки уже сигнал подавало. Провести шлейф далее к окнам, на которые можно наклеить по периметру тонкую полосочку фольги или очень тонкий обмоточный провод (0.08-0.1 мм), можно также поставить и «ударный» датчик, если есть вероятность вскрытия окна без взлома, то и датчик отпирания. Также и при возможности взлома стены — тонкий обмоточный провод (0.08-0.1 мм), можно также поставить и «ударный» датчик. Кнопка квитации сигнала может быть вмонтирована в виде геркона в стену неподалёку от двери, зашёл, быстро провёл магнитом в нужном месте и квитировал сигнал. Можно также и вовсе отключить сигнализацию, но она не должна быть так близка и доступна для взломщика.

При отключении сети питания схема может работать от любого бесперебойника, потребление у неё очень малое. Вот сигнальное устройство другое дело, если это сверчалка на пьезокристале, то потребление тоже незначительное, но если ревун и лампа, тогда по более.

Теперь конкретно про работу самой схемы. Шлейф задействован сразу на два типа контроля:

1 — довзломного предупредительного и 2 — послевзломного сигнализирующего. Разделяются они передачей сигнала разрыва цепи каждый своей полярностью полуволны переменного тока. Для этого установлены развязывающие диоды VD4 — VD15.

На светодиод  оптрона U1 собираются датчики послевзломные, а на оптрон U2 – предупредительные. При этом на каждый тип контроля датчика/группы датчиков (на пример вместо одного датчика вибраций SFI2 на окне могут стоять несколько последовательно подключённых с одним развязывающим диодом) ставится свой развязывающий диод. В любой точке разрыва ставятся оба развязывающих диода, даже если в данной точке только один тип контроля, т.

к. должны пройти обе полуволны периода переменного тока (на пример VD14 в точке «СТЕНА»). Напряжение питания шлейфа зависит от длины самого шлейфа, от количества точек контроля, от падения напряжения на диодах, — чем длиннее шлейф и больше точек контроля, тем выше напряжение. А ток светодиодов оптронов задаётся резистором R13. 

Транзисторы оптронов постоянно открыты и разряжают электролиты C1,C7. В случае разрыва шлейфа при срабатывании хотя бы одного датчика соответствующий транзистор оптрона закрывается и успевает зарядиться соответствующая ёмкость (C1,C7). Для чёткого срабатывания схемы, особенно для датчиков вибраций возможна подборка сопротивления R7 и ёмкости C7, этим можно установить чувствительность на силу ударов и вибраций. Далее реагируют реализованные резисторами R2,R4,R8,R9 компараторы, которые защищают от помех и создают определённый гистерезис срабатывания триггеров на элементах IC1.1 и IC1.2 первый, IC2.1 и IC2.2 второй. На элементе IC1.3 собран формирователь сброса счётчика IC3.

При срабатывании хотя бы одного из триггеров сброс на 3 ножке счётчика исчезает и начинается счёт импульсов внутреннего генератора этого счётчика. Генератор собран на внутренних элементах счётчика и на резисторе R10 и ёмкости C6, коими задаётся частота генерации и, следовательно, общее время периодов счётчика. А дискретно время предупредительного сигнала, время отсрочки сигнала взлома выбирается перемычками на печатной плате. Здесь файлы платы и схемы.

На элементе  IC2.3 собран сумматор двух серий импульсов

  • одна серия для периодического включения сигналов с длительностью от половины до одной секунды.
  • другая серия служит для подачи импульсов достаточно высокой частоты (около килогерца) для подачи на импульсный трансформатор, если необходимо коммутировать сигнальные устройства (на пример ревун), работающие от сети ~ 220В. Если такой коммутации нет, и сигнальное устройство можно просто подключать транзистором T1, то быстрая серия отключается перемычкой на плате.

На элементе IC1.4 собран формирователь разрешения выходного сигнала, и разрешение будет дано при срабатывании триггера IC2.1 и IC2.2 сразу или при срабатывании триггера IC1.1 и IC1.2 с отсрочкой. Первый триггер (IC2.1 и IC2.2), срабатывая, сразу подаёт сигнал разрешения, и только счётчик, отсчитав определённый период времени (дискретно задаётся перемычками на плате) сбросит триггер, и триггер подаст запрет на выходной сигнал. Второй триггер (IC1.1 и  IC1.2) лишь убирает сброс с 3-й ножки счётчика, который, после отсчёта отсрочки (дискретно время отсрочки выбирается перемычками на плате) выставляет разрешение (лог. единица на ножке 4 или 5 счётчика) на выходной сигнал. Элемент IC2.4 выходной, в случае отсутствия разрешение на выходной сигнал он формирует лог. ноль и запирает выходной ключ на транзисторе T1.

Блок питания и сигнальные устройства

Схема питается от стабилизатора на стабилитроне VD1 и резисторе R5, реализованного на плате 1. Выпрямительный мостик VDS1  и сглаживающий электролит C5 питания схемы реализованы на плате 2. Где так же реализовано коммутирующее устройство на тиристоре  T2, импульсном трансформаторе Tr1, мостике VDS2 и резисторе R11. Сигнальные устройства могут быть разные: ревун на ~220В; звонок на ~220В; лампы; с генератором на пьезокристалле; от автосигнализации; даже вызывное устройство от телефона на пьезокристалле (если не нужна большая мощность звука). Специально для сайта Радиосхемы —

ПНП НПН.

   Форум по сигнализациям

   Форум по обсуждению материала СИГНАЛИЗАЦИЯ СВОИМИ РУКАМИ



SMD ПРЕДОХРАНИТЕЛИ

Приводятся основные сведения о планарных предохранителях, включая их технические характеристики и применение.





Как сделать простейшую охранную систему на одном транзисторе | Энергофиксик

Вы только в начале изучения удивительного мира электроники и ищите простые схемы для практической сборки? Тогда я хочу предложить вашему вниманию самую простую сторожевую сигнализацию, выполненную на одном транзисторе. Реализовав такую схему, вы ее даже сможете установить на входе, например, в мастерскую и всегда будете знать, что к вам направляются гости (желанные или не очень). Итак, начнем.

Рассматриваем схему и принцип ее работы

Но перед тем как приступить к сборке нашей схемы, давайте изучим ее и разберем, каким образом она работает.

Как видите схема предельно простая и работает она следующим образом: до тех пор, пока охранный провод не имеет разрывов и включен в цепь, по цепочке «+» элемента питания — Резистор – Охранный провод – Минус элемента питания будет протекать электрический ток.

И весь ток будет течь именно через охранный провод, а это означает, что транзистор будет закрыт. Для того, чтобы он открылся необходима разница напряжения между эмиттером и базой 0,5 – 0,7 Вольт.

И в таком состоянии схема может находиться очень долгое время (пока не разрядится элемент питания), но как только мы разрываем охранный провод, в тот же миг увеличивается напряжение на базе до 0,5-0,7 Вольт, транзистор открывается и по пути эмиттер — коллектор начинает протекать ток. Теперь цепочка работы схемы выглядит следующим образом:

«+» элемента питания – зуммер – транзистор – минус элемента питания. И в это время зуммер просто неистово трезвонит. С принципом работы вроде все ясно, теперь давайте перейдем к непосредственной сборке.

Сборка схемы

Для того, чтобы собрать нашу схему понадобится:

1. Транзистор. Подойдет практически любой, главное чтобы у него был — переход N-P-N типа.

2. Зуммер (я его покупал здесь). В принципе если его нет, то вполне можно заменить, например, маломощной лампочкой или светодиодной летной, рассчитанной на 12 Вольт.

3. Источник 12 Вольт. Я буду использовать регулируемый блок питания.

4. Соединительные провода, охранный провод и паяльник.

Так как схема предельно простая, то я сразу покажу результат сборки и теста схемы.

Заключение

Как вы видите, схема рабочая и собирается предельно просто. Вы также можете собрать ее со своим ребенком. Возможно, эта работа распалит интерес к изучению электроники, физики и других наук у вашего чада. Понравилась статья, тогда поставьте палец вверх, это позволит показать статью как можно большему числу людей.

Если у вас есть интересные идеи, то милости просим в комментарии. Спасибо за ваше внимание!

Схема простой сигнализации на к561ла7. Охранная сигнализация на микросхеме CD4023. Вкратце о принципе работы сигнализации

Вариант 060. «Простая сигнализация на К561ЛА7» в коробке

Ниже вашему вниманию представлена схема простой и надёжной сигнализации на одной микросхеме К561ЛА7. Из четырёх логических элементов «2И-НЕ» собрано два генератора. Генератор низкой частоты на элементах DD1.1 и DD1.2 управляет генератором звуковой частоты на элементах DD1.3 и DD1.4, формируя тревожный сигнал. Пьезоизлучатель можно подключить между 11 и 12 выводами микросхемы, тем самым упростив устройство, но в этом случае сигнал, издаваемый пьезоизлучателем QZ1 был бы слабым.

Поэтому в схему добавлен усилитель на транзисторах VT1 и VT2, соединённых по двухтактной схеме эмиттерного повторителя образующих комплементарную пару. Но и в этом случае тревожный сигнал был бы недостаточной силы, т.к. для работы пьезоизлучателя в полную силу требуется относительно высокое напряжение на его пластинах. Этого результата можно добиться подключив к выходу эмиттерного повторителя повышающий автотрансформатор Тр1, исполненный на ферритовом кольце. С помощью этого автотрансформатора напряжение на входе пьезоизлучателя увеличивается в 10 раз и сигнал тревоги становится достаточно громким, чтобы его услышать с большого расстояния. Количество витков трансформатора около 900. Количество витков меньшей обмотки (выводы 1 и2) 80 витков. После её намотки делается отвод сдвоенным проводом и вторая обмотка (выводы 2 и 3) доматывается до израсходования оставшегося провода. Рассмотрим работу схемы. После подачи питания на схему (напряжение питания может находиться в диапазоне 6 – 15 вольт) устройство переходит в дежурный режим. На вывод 2 через нормально замкнутые контакты кнопки SA1 поступает логический ноль, дающий запрет на работу первого генератора. Соответственно на выводе 4 будет тоже логический ноль, не позволяющий работать второму генератору. Устройство в таком режиме потребляет очень незначительный ток в пределах нескольких микроампер. Как только контакты размыкаются, через резисторы R1, R2 на 2 вывод подаётся логическая единица, что приводит к запуску первого генератора, работающего с частотой около 2Гц. В тот момент, когда на выводе 4 появляется логическая единица, поступающая на 8 вывод, включается второй звуковой генератор. Звуковая частота с вывода 11 поступает на вход повторителя на VT1, VT2. Далее усиленный сигнал через конденсатор С4 поступает на обмотку (1,2) автотрансформатора Тр1. Ток, проходящий через эту часть обмотки трансформатора создаёт переменный магнитный поток в сердечнике (кольце), который в свою очередь индуцирует во всей обмотке электродвижущую силу, пропорциональную количеству витков. В результате на пьезоизлучатель поступает сигнал звуковой частоты с повышенным, относительно напряжения источника питания, напряжением. В зависимости от задач, кнопку можно заменить на нормально разомкнутую, замкнув её в положение охраны или заменив кнопку тонким проводом по принципу растяжки на разрыв.

Пролог


На элементах DD1.3 и DD1.4 собран ещё один мультивибратор, частота работы которого около 1кГц. Времязадающая цепь – С3, R3. Эпюра снята с 11-ой ножки микросхемы, когда мультивибратор работал постоянно.


Когда на 4-ой ножке появляются импульсы с частотой следования 3 Герца, на выходе DD1.4 (11-ая ножка), соответственно, появляется прерывистый сигнал частотой 1 килогерц. Эпюра снята с 11-ой ножки во время срабатывания тревоги.


Выход DD1.4 подключен к транзисторному ключу VT1, который управляет работой динамика Ba1. Здесь используется составной транзистор с большим коэффициентом усиления по току. Если под рукой не окажется такого транзистора, то можно его заменить самодельным составным транзистором.

Потенциометр R4 позволяет установить оптимальный уровень громкости сирены.

Резисторы R5, R6 ограничивают выходной ток микросхемы. Желательно выбирать сопротивление этих резисторов не менее 1-го килоома на каждый Вольт питания.

Резисторы R7 и R8 ограничивают ток светодиодов. А от сопротивления резистора R8 ещё и зависит основной ток потребления в дежурном режиме.

Конденсатор С1 защищает входные цепи микросхемы от помех, которые могут быть наведены на контур электромагнитным излучением.

Защитные диоды VD1 и VD2 защищают схему от мощного электрического импульса, который может быть вызван молнией. В этом случае, предохранитель FU1 может защитить шлейф от обрыва, хотя и не всегда.

Конденсаторы С4 и C5 – фильтр питания.

Напряжение питания этого охранного устройства можно выбрать в диапазоне 6… 12 Вольт. Можно применить несколько соединённых последовательно элементов АА, ААА или 9-ти Вольтовую батарею типа «Крона».

Потребление энергии во время срабатывания сирены, зависит от уровня громкости, установленного потенциометром R4, а при максимальной громкости, от сопротивления динамической головки Ba1. Потребление в дежурном режиме в основном определяется сопротивлением резисторов R1 и R8.

Но, если, для экономии энергии батареи, резистор R8 можно вообще исключить вместе со светодиодом VD4, то значительно увеличивать сопротивление резистора R1 нежелательно, особенно, если длина провода составляет 100 и более метров.

Схема этой охранной сигнализации, рассчитана на работу с датчиком обрывного типа. В качестве датчика используют тонкий медный эмалированный провод типа ПЭВ, ПЭЛ и им подобный. Диаметр провода выбирают исходя из следующих соображений. Чем тоньше провод, тем вероятнее ложное срабатывания, но и тем менее вероятно, что нарушитель заметит его или почувствует при соприкосновении. Так что, выбирать следует в диапазоне диаметров 0,05… 0,1мм. Спокойно идущий человек может не почувствовать обрыв провода диаметром 0,05мм даже открытой частью тела. Но, не порвать такой провод ещё при прокладке будет сложно. Для прокладки тонкого провода можно использовать лёгкую катушку, вращающейся в подшипниках.


На этом макете была опробована работа охранной системы.


Чертёж печатной платы на основе одного из широко распространённых типов макетных плат.

Как это работает? Откройте на весть экран и выберите разрешение 1280х720px.

Особенность этой сигнализации в том, что её практически не меняя схемы можно установить на автомобиль, входную дверь помещения, сейф, и даже на шкаф. Разница только в том. что за нагрузка будет на выходе и какой источник питания. А модификация производится переключением миниатюрной перемычки в разъеме, установленном на плате сигнализации. Нагрузкой сигнализации может служить 12-вольтовая автомобильная сирена, промежуточное реле или миниатюрная покупная или самодельная сирена.

А функции датчика может выполнять пара геркон-магнит, замыкающий или размыкающий выключатель, автомобильные контактные датчики, разрывной шлейф, контактная закладка.

Принципиальная схема базового варианта показана на рисунке 1. Такая сигнализация может работать с одной группой замыкающих датчиков (SD2) или одной группой размыкающих датчиков (SD1). Выбор типа датчиков осуществляется перестановкой перемычки N1 (на схеме она показана в положении работы с замыкающим датчиком SD2, а пунктиром, — для работы с размыкающим SD1).

Если на охраняемом объекте несколько замыкающих датчиков, то их нужно включить параллельно друг другу, а если датчики размыкающие, — последовательно.

Включают сигнализацию выключателем S1, через который подается питание. Индицирует факт включения светодиод HL1 постоянного свечения После включения отрабатывается выдержка в несколько секунд, в течение которой сигнализация реагирует на срабатывание датчика коротким звуковым сигналом. Величина этой выдержки определяется параметрами RC-цепи R3-C2.

Выдержка нужна для выхода из объекта охраны, закрывания дверей и проверки работоспособности датчиков. По завершению выдержки сигнализация переходит в режим охраны, что индицируется включением мигающего светодиода HL2 Диод VD4 и резистор R5 перестают шунтировать R6 и продолжительность сигнализации. зависящая от быстроты разрядки С3, увеличивается.

Теперь, при срабатывании датчика на выходе D1.1 появляется положительный импульс, длительность которого зависит от параметров цепи R2-C1. Этот импульс через диод VD3 и токоограничивающее сопротивление R4 заряжает конденсатор С3 до напряжения логической единицы. На выходе D1.2 формируется отрицательный импульс, продолжительность которого зависит от быстроты разрядки конденсатора С3.

По фронту этого импульса, цепью C6-R8 формируется короткий импульс, который приводит к кратковременному появлению логической единицы на выходе D1 3. А это приводит к кратковременному включению сирены BF1. Раздается короткий предупредительный сигнал, после которого у вас есть несколько секунд на отключение сигнализации выключателем S1, который должен быть размещен внутри охраняемого объекта скрытно.

Продолжительность этой задержки зависит от параметров цепи R7-C4. Если сигнализация не будет выключена в течение этой задержки, то включается продолжительный режим сигнализации (сирена звучит примерно 50 секунд).

Затем схема возвращается в охранный режим. Конденсатор С1 необходим для исключения зацикливания схемы в том случае, когда после вторжения на объект датчик остается в сработавшем положении

При установке на автомобиле в качестве устройства оповещения BF1 используется стандартная блок-сирена для автомобильных сигнализации промышленного производства. В этом случае питание от автомобильного аккумулятора, а датчик удобнее выбрать замыкающий, потому что именно такие дверные выключатели освещения, а так же, автоматические выключатели света под капотом и в багажнике.

Если эти датчики не допустимо включать параллельно, их можно развязать между собой диодами типа КД522. Подключив эти диоды анодами к аноду VD2, а их катоды соединить с датчиками.

При охране помещения удобнее применить размыкающий датчик, потому что, именно такие стандартные герконовые датчики, устанавливаемые на двери. Если же датчик самодельный, то выбор типа зависит от его конструкции. Тип сирены так же зависит от многих факторов. Можно использовать такую же автомобильную сирену, или через промежуточное реле подключить более мощную сирену, питающуюся от электросети, либо кнопку вызова охраны.

Впрочем, можно дополнительно сирене подключить реле для включения кнопки вызова охраны. В таком случае, обмотку реле подключают параллельно сирене. Чтобы не повредить транзисторы выходного ключа (VT2 и VT3) выбросом самоиндукции необходимо параллельно обмотке реле включить любой диод в обратном направлении. Тип реле зависит от нагрузки, но обмотка должна быть рассчитана на напряжение 8-14V. В таких же пределах должно быть и напряжение питания сигнализации.

Рис.2
Детали размещены на печатной плате с односторонним расположением дорожек. Схема разводки и схема расположения деталей даны на рисунке 2.

Способ изготовления платы, — любой доступный. Монтаж неплотный, поэтому печать можно нарисовать даже при помощи заточенной спички, по мере надобности макаемой в битумный лак или нитроэмаль.

Впрочем, монтаж можно выполнить и на макетной печатной плате или вообще без платы, приклеив микросхемы «вверх ногами» на какую-то основу, и выполнив соединения монтажными проводниками и выводами деталей.

Микросхему К561ТЛ1 можно заменить аналогом серии К1561 или импортной CD4093. Микросхема К561ТЛ1 содержит четыре элемента «2И-НЕ», с входами, выполненными по схеме триггера Шмитта Цоколевка и логика работы почти как у К561ЛА7, поэтому можно попробовать использовать вместо К561ТЛ1 микросхему К561ЛА7, но только в крайнем случае, потому что у элементов К561ЛА7 нет на входах триггеров Шмитта, и схема, скорее всего, будет работать менее устойчиво и выдержки будут отрабатываться не так четко.

Транзисторы КТ315 и КТ815 заменимы любыми другими транзисторами общего применения анапогичной мощности. Диоды так же можно заменить любыми аналогами. Светодиод НИ — любой индикаторный с постоянным свечением, a HL2 — мигающий. Схема, показанная на рисунке 1 является базовой. В ней используется только одна микросхема малой степени интеграции, отсюда и ограниченные функции.

Усложнив ее добавлением еще одной такой же микросхемы (рис. 3) можно сделать более универсальную сигнализацию. В схеме, показанной на рисунке 3, есть два входных канала (дополнительный канал выполнен на D2. 1). Это позволяет работать одновременно с двумя типами датчиков, — на одном канале может быть система замыкающих датчиков, а на втором, — размыкающих

Охранная сигнализация. Схема

Сигнализация сделана на простой и доступной микросхеме CD4023 (или любой другой…4023), в которой есть три логических элемента «3И-НЕ». Несмотря на простоту, сигнализация обладает вполне неплохим набором функций, и может поспорить с аналогичными устройствами, собранными на специализированных микросхемах или микроконтроллерах. К тому же, применение простой «жесткой» логики делает и изготовление сигнализации очень простым и доступным, поскольку не требуется никакого программирования или поиска дорогих или редких микросхем.

Сигнализация рассчитана на работу с пятью контактными датчиками, сделанных из концевых переключателей. Один датчик -SD5 специализированный, он устанавливается на входную дверь. Четыре остальных могут быть установлены на окна, ставни, другие двери, люки, лазы и т. д. В закрытом состоянии контакты датчиков разомкнуты, и замыкаются при открывании соответствующей двери, окна, ставни, люка, лаза и т.д. То есть, когда закрыто, шток концевого переключателя нажат, значит, подключать надо его размыкающие контакты.

Алгоритм работы сигнализации следующий. Включение осуществляется выключателем питания. О факте включения индицирует один светодиод. После включения сигнализация примерно 15 секунд не реагирует на датчики. Однако, в течение первых 2-3 секунд после включения питания схема проверяет все датчики кроме основного дверного. Если какой-то из датчиков замкнут (например, окно не закрыли), то раздается звуковой сигнал длительностью 2-3 секунды и загорается светодиод, который показывает на конкретный датчик, находящийся в замкнутом состоянии. Если замкнуто несколько датчиков, соответственно, будут гореть несколько светодиодов.

После устранения неполадки нужно снова включить питание сигнализации. Далее, если все датчики в норме, будет гореть только светодиод, индицирующий включение питания. Через примерно 15 секунд после включения питания сигнализация переходит в режим охраны. Теперь, если любой из датчиков будет замкнут (или несколько из них) включится электронная блок-сирена, которая будет звучать около 15 секунд. Затем, система вернется в режим охраны и будет ожидать срабатывания очередного датчика.

Отключение сигнализации происходит в два этапа. Сначала посредством клавиатуры набирается код, после чего схема блокируется на 15 секунд, в течение которых, можно войти внутрь помещения и отключить сигнализацию выключателем питания. Если же, войти в помещение и не выключить питание сигнализации, то через 15 секунд она войдет в режим охраны, и сработает когда вы откроете дверь или окно, или еще что-то, что находится под охраной, даже если вы внутри помещения.

Для задания и набора кода используется простая электромеханическая цепь из последовательно включенных кнопок-переключателей. Такие кодовые замки неоднократно описывались в этом журнале, и несмотря на такие неудобства, как необходимость одновременного нажатия кнопок кодового числа, и невозможность изменить код без разбора и перепайки, они весьма эффективны, дешевы и
просты, что тоже немаловажно.

Сигнальным устройством служит электронная сирена для автомобильных сигнализаций, — на сегодня это наиболее доступное сигнальное устройство.

Теперь о схеме. Основу схемы составляет трехвходовый RS-триггер на двух элементах микросхемы D1 типа 4023.
Датчики двух типов. Дверной датчик основной двери — SD5, он подключен непосредственно к выводу 2 D1.1. Он не проверяется светодиодом и звуковым сигналом при включении питания, потому что он расположен на основной двери, служащей для выхода из помещения, а проверка датчиков начинается сразу после включения питания, то есть, пока человек, включивший питание, еще находится внутри помещения.
Остальные датчики SD1-SD4 снабжены светодиодами для контроля состояния и RC-цепями, формирующими при замыкании датчика импульс длительностью 2-3 секунды.

Через развязывающие диоды VD1-VD4 они подключены к выводу 1 D1.1.
При включении питания выключателем S10 начинается зарядка конденсатора С6 через резистор R11. При емкости 10 мкФ и сопротивлении 1 М, у меня получилось до единицы около 15 секунд, хотя здесь играет роль и точность емкости конденсатора, и величина утечки, так что результат может быть и другим. Ну так вот, в течение этого времени, пока С6 заряжается через R11, на выводе 4 D1.2 присутствует напряжение низкого логического уровня. Поэтому, RS-триггер D1.1-D1.2 находится в зафиксированном положении, и на выходе D1.2 логическая единица независимо от того, что на входах элемента D1.1. Поэтому, в течение этого времени триггер не реагирует на датчики.

В то же время, если после включения питания окажется что один из датчиков SD1-SD4 замкнут, то, например, если это был SD1, цепь R2-C1 создаст импульс длительностью около 2-3 секунд, который через диод VD1 поступит на вывод 11 D1.3, и на его выходе на 2-3 секунды появится высокий логический уровень. Транзисторный ключ VT1-VT2 откроется на 2-3 секунды, и прозвучит короткий предупредительный звук. А светодиод HL1 будет гореть, показывая, что замкнут именно датчик SD1.

После зарядки С6 схема переходит в режим охраны. Теперь, при срабатывании любого из датчиков RS-триггер D1.1-D1.2 перекидывется в ноль на выходе D1.2. При этом на выходе D1. 3 устанавливается высокий логический уровень, и транзисторы VT1-VT2 открываются, звучит сирена BF1. Но, продолжается это только до тех пор, пока конденсатор С5 заряжается через резистор R12, то есть, тоже около 15 секунд. Хотя, это время зависит так же, от фактической емкости конденсатора С5 и величины его тока утечки.

Для первой стадии отключения сигнализации используется клавиатура из кнопок S0-S9 (кнопки понумерованы согласно надписям возле них на наборной панели). Все кнопки переключающие, без фиксации, включены последовательно, но так, чтобы кнопки кодового числа были подключены замыкающими контактами, а все остальные — размыкающими. И эта цепь включена параллельно С6. Цепь замыкается только в том случае, если одновременно нажать только кнопки кодового числа. При этом, С6 разряжается, и схема переходит в то состояние, в котором она бывает после включения питания. То есть, примерно 15 секунд не реагирует на датчик двери SD5.

Монтаж выполнен на макетной печатной плате промышленного производства.

Время задержки после включения питания можно установить подбором R11 или С6. Время звучания сирены — подбором R12 или С5.
К данной системе можно пристроить и сотовый телефон для дистанционной передачи сигнала (Л.1).

Хотя ее при желании можно без проблем установить и в .
Схема сигнализации предполагает наличие одной цепи охраны (с задержкой на постановку и сработку), но при небольшой доработке, вполне можно добавить сколько угодно цепей мгновенной сработки (подключить датчики на разбитие стекла, датчики движения, и т.д.). Плюсом данной схемы является возможность независимой регулировки таймеров задержки:

  • Задержка постановки на охрану — регулировка времени от момента включения системы, до момента, когда хозяин квартиры должен покинуть помещение и закрыть дверь, тем самым замыкая цепь охраны.
  • Задержка на включение сирены — регулировка времени от момента открытия двери, до момента включения системой акустического ревуна. То есть время за которое необходимо успеть войти в квартиру и обесточить сигнализацию.

Еще раз подчеркну, таймеры задержек регулируются независимо и не влияют друг на друга , как это, зачастую, встречается в простых охранных системах на логических микросхемах. Принципиальная схема сигнализации изображена на рисунке №1. Схема реализована на 2-х логических микросхемах: К561ЛА7 и К561ЛН2, которые запитаны от 5 Вольтового стабилизатора напряжения. Применение стабилизатора, конечно, сводит на нет преимущества микросхем серии К561 а именно сверх низкий ток потребления, но избавляет от проблемы изменения времени задержек, при снижении . Время задержки постановки на охрану зависит от номинала конденсатора С1, чем больше его емкость, тем длиннее период задержки. Задержка на включение сирены определяется номиналом конденсатора С3, чем больше его емкость, тем больше времени для отключения охранной системы после размыкания контактов охранного шлейфа.

Вкратце о принципе работы сигнализации:

Сначала необходимо рассмотреть участок схемы который непосредственно связан с охранным шлейфом.

Нас интересует один из логических элементов микросхемы DD1 К561ЛА7 который отвечает за сработку системы, а именно передачу импульса для мгновенной зарядки конденсатора C2 емкостью 2200мкФ (который определяет время работы сирены в случае если дверь после несанкционированного проникновения будет сразу закрыта, но сигнализация останется включена). Рассмотрим процессы происходящие после сработки системы (т.е. после мгновенной зарядки конденсатора С2 2200мкФ) о том в каком случае происходит такая сработка будет сказано позже, что бы не запутаться в происходящем. Итак, из энергии С2 2200мкФ через диод VD2 и резистор R5 620k происходит медленный заряд конденсатора С3 200мкФ. Этот этап является задержкой на включение сирены, как уже говорилось, чем выше емкость С3, тем больше времени пройдет перед включением сирены. Итак, С3 медленно заряжается, и в определенный момент, напряжение на конденсаторе доходит до значения (порядка 3 Вольт), при котором происходит сработка инверторов, выполненных на микросхеме DD2 К561ЛН2. После двухкратной инверсии сигнала, с вывода №4 микросхемы DD2 поступает напряжение питания на токоограничительный резистор ключа, выполненного на биполярном транзисторе КТ819Г. Данный ключ «проключает землю», то есть во включенном состоянии пропускает через себя ток и включает сирену.

Нам осталось разобраться как работает задержка постановки на охрану и при каких обстоятельствах произойдет включение сирены. Итак, при включении охранной системы происходит медленный заряд конденсатора С1, определяющего время задержки постановки на охрану. При достижении напряжения на конденсаторе С1 выше порога сработки (порядка 3 вольт), состояние выхода первого логического элемента микросхемы DD1 К561ЛА7 (ножка 3 микросхемы) поменяет свое состояние: сразу при включении на на этом выводе микросхемы будет напряжение равное напряжению питания, т.е. 5 Вольт, а при заряженном конденсаторе С1 (по окончании времени задержки на постановку) на данной ножке микросхемы напряжение станет равным нолю. Идем дальше по схеме, сигнал поступает на второй логический элемент микросхемы DD1 на котором происходит его инвертирование. Попросту говоря если на входах элемента №6,№5 будет ноль, то на выходе элемента (лапка №4) появится . И на оборот, если на обоих входах (№6,№5) элемента появится полное напряжение питания (5Вольт) , то на выходе элемента напряжение станет равным нолю. Для сброса таймеров (в случае когда, вы по каким-либо причинам не успеваете выйти и запереть за собой дверь) необходимо нажать на несколько секунд строенный переключатель без фиксации положения (кнопку) который произведет разряд всех время-задающих конденсаторов через номиналом в 5 Ом. Производить сброс таймеров также необходимо после каждого выключения охранной сигнализации . Можно объединить кнопку отключения питания и кнопку сброса воедино, если найдете подходящий переключатель с фиксацией положения и возможностью комутации 4 пар контактов. Остается последний непоясненный вопрос.

Мы опять возвращаемся к рассмотрению логического элемента №3 микросхемы DD1 К561ЛА7. Как уже было сказано выше инверсия сигнала произойдет когда на обоих входах логического элемента появится напряжение питания. То есть, если на входе №9 и входе №8 будет +5 Вольт, на выходе данного элемента (ножка №10) напряжение станет равным нолю. С выхода №10 сигнал «ноль» будет подан на точно такой же элемент, который так же инвертирует сигнал и на выходе последнего логического элемента микросхемы DD1 К561ЛА7, то есть на ножке №11 появится напряжение +5 Вольт, которое произведет через диод VD1 мгновенную зарядку конденсатора 2200мкФ. Что происходит далее, было описано выше.

Итак, самый главный фрагмент описания действия сигнализации!

Охранный шлейф является нормально замкнутым , то есть в режиме «под охраной» кнопка замкнута, а в режиме открытия двери цепь размыкается. Что это нам дает, применимо к схеме? Сигнал, на сработку сирены, через заданное количество секунд будет подан лишь в том случае, когда на обоих входах станет напряжение равным 4-5 Вольт. Это может произойти только лишь в случае, когда охранный шлейф разомкнут, (в этом случае на вход №8 через резистор R11 номиналом 100к будет подано напряжение 5 Вольт). И когда на входе №9 появится напряжение 5 Вольт, а это произойдет после окончания времени задержки постановки на охрану. Обязательно еще посмотрите
PS/ Я старался изложить принцип действия самодельной охранной сигнализации максимально лаконично и доступно, для понимания начинающим любителям самоделок. Если улучшите эту модель – пришлите, пожалуйста фото и схему Вашего варианта охранной сигнализации, я буду очень вам признателен и размещу её в этом разделе. Заранее спасибо.

Вы также можете прислать любые свои самодельные кострукции, и я с удовольствием их размещу на этом сайте с указанием Вашего авторства! samodelkainfo{собачка} yandex.ru

Схема простой сигнализации для помещения » S-Led.Ru


Сигнализация предназначена для охраны складского помещения. Схема очень проста как в сборке и налаживании, так и в эксплуатации. Работает на сирену для автомобильной сигнализации. Датчик — контактный, на размыкание (при открывании двери контакты датчика расходятся или отходит постоянный магнит от замыкающего геркона).

Постановка и снятие с охраны производится снаружи помещения. Здесь могут два варианта. В первом случае, роль выключателя сигнализации выполняет тройка болтиков или гвоздиков на наружной поверхности двери, которые нужно замкнуть металлическим предметом, во втором случае, это могут быть герконы, замаскированные в обивку двери, деревянную обшивку. В этом случае установка на охрану и снятие с охраны выполняется поднесением к определенному месту ключа — постоянного магнита.

Индикация «включено-выключено» при помощи двух светодиодов разных цветов. Питается система от источника постоянного тока напряжением 9…15V, это может быть сетевой адаптер, аккумулятор или бесперебойная комбинация из адаптера и аккумулятора. Важно, чтобы источник питания был рассчитан на ток, потребляемый сиреной (обычно 0.3…1 А).

Принципиальная схема показана на рисунке. Как видно, это два RS-триггера. Первый из них на элементах D1.1 и D1.2 предназначен для выполнения функции выключателя, а второй -на элементах D1. 3 и D1.3 несет функцию «охранной защелки». При размыкании контактов S1 он принимает нулевое состояние, что приводит к открыванию транзисторов VT1 и VT2 и включению сирены В1. Звучать будет до тех пока её не выключат.

Включение и выключение производится замыканием точек Х1, Х2, Х3. Для того чтобы поставить объект на охрану нужно замкнуть точки X2 и Х3. При этом на вывод 6 D1.2 подается логический ноль. Триггер D1.1-D1.2 переключается в единичное положение и позволяет второму триггеру (D1.3-D1.4) быть установленным в нулевое положение при подаче уровня логического нуля на вывод 13 D1.4. При постановке на охрану зажигается светодиод HL1 красного цвета. Чтобы выключить сигнализацию или снять объект с охраны нужно замкнуть точки Х1 и X2, при этом зажигается светодиод HL2 зеленого цвета. Лог. ноль подается на вывод 8 D1.3 и триггер D1.3-D1.4 принудительно устанавливается в едининочное положение и удерживается в нем.

Вся схема (кроме источника питания и сирены) собрана на одной печатной плате с односторонним размещением печатных дорожек. Микросхему K561J1A7 можно заменить аналогом серии К1561ЛА7 или импортным. Если используется микросхема К176ЛА7, то напряжение источника питания не должно быть больше 10-11 В.

Светодиоды — импортные, неизвестной марки. Их можно заменить любыми светодиодами общего применения, видимого спектра излучения и разного цвета. Можно один из светодиодов убрать, например, HL2, тогда, HL1 будет индицировать включение на охрану. Транзистор КТ361 можно заменить аналогичным КТ3107. Транзистор КТ817 — на КТ815, КТ819, КТ805, КТ807.

Сигнализация эксплуатируется уже около трех лет, и показала себя как простое и надежное устройство.

Простая охранная сигнализация » Схемы электронных устройств

Это устройство может дополнить систему охранной сигнализации или использоваться для радиовызова сотрудника, дистанционно сообщить о изменении в каком-либо процессе, если дальность передачи не превышает 300 метров. В авторском варианте радиосигнализация дополняла обычную автомобильную сигнализацию, использующую в качестве звукоизлучателя автомобильный сигнал. Передатчик по цепи питания подключен параллельно реле звукового сигнала, так что при срабатывании сигнализации, на него подается питание прерывисто.
В основе устройства лежит схема частотного кодирования, принятая в простых устройствах радиоуправления. Состоит из двух узлов -передатчика и приемника. Несущая частота радиоканала 27,12 мгц, частота кодирования — 1100 гц. Модуляция амплитудная с глубиной 50%. Мощность передатчика 150 мвт, чувствительность приемника 3 мкв/м.

Передатчик (схема показана на рисунке 1) состоит из однокаскадного высокочастотного генератора, нагруженного антенной, частота которого стабилизирована кварцевым резонатором, генератора модулирующей частоты, и модулятора.

Генератор выполнен на операционном усилителе DA, он вырабатывает синусоидальные колебания частотой 1100 гц (для конфетного устройства можно выбрать другую частоту), которые затем поступают на вход модулятора, сделанного на транзисторе VT1. В эмиттерной цепи этого транзистора включен высокочастотный генератор на транзисторе VT2 — собственно передатчик.

Благодаря наличию резистора R17 транзистор VT1 постоянно находится в частично открытом состоянии, и на генератор поступает напряжение питания. При поступлении на базу этого транзистора переменного модулирующего напряжения от генератора НЧ сигнала степень открытости этого транзистора изменяется, и соответственно изменяется напряжение питания генератора ВЧ.

В результате изменяется и уровень выходного сигнала. Таким образом осуществляется амплитудная модуляция. Принципиальная схема приемника показана на рисунке 2. Сам радиоприемный тракт выполнен на специализированной микросхеме К174ХА2, специально разработанной для использования в AM трактах радиоприемников до 30 мгц.

Входной сигнал от антенны поступает симметричный вход преобразователя через контур L1C2, который выделяет сигнал. Частота гетеродина стабилизирована кварцевым резонатором ZQ1 на 26,655 мгц или 27,585 Мгц, промежуточная частота 465 кгц выделяется в контуре L4C7. Для простоты и повышения чувствительности в данной схеме не используется пьезоэлектрический или какой либо другой фильтр сосредоточенной селекции, выделение сигнала ПЧ производится только двумя контурами L4C7 и предетекторным, включенным на выходе УПЧ -L6C12.

Такая упрощенная схема выделения сигнала ПЧ удобна и тем, что позволяет расширить выбор кварцевых резонаторов, ведь ПЧ может быть любой в пределах 300-800 кгц, нужно только изменить емкости С7 и С12.

С выхода детектора на VD1 низкочастотный сигнал поступает на фильтр на операционном усилителе DA2, который пропускает и усиливает только сигнал с частотой в полосе 900-1500 гц. В результате при приеме сигнала, модулированного частотой 1100 гц, НЧ напряжение поступает на базу транзистора VT1 и он начинает периодически открываться, постепенно заряжая конденсатор С27.

Как только напряжение на нем достигает 1,3-1,5В открывается составной транзистор на VT2 и VT3. В результате подается напряжение на генератор звукового сигнала на транзисторах VT4 и VT5 и электромагнитном капсюле BF1 -ТМ-2М.

В передатчике и приемнике используются наиболее распространенные радиодетали. Транзисторы КТ315 можно заменить на КТ3102, транзисторы КТ361 — на КТ3107. В высокочастотном генераторе можно использовать КТ608, КТ603, КТ630.

Для намотки контуров ВЧ используются каркасы с подстроечниками от модулей цветности телевизоров УСЦТ, от них-же и экраны. Катушки передатчика имеют такие данные: L1 — 12 витков , L2 — 18 витков, обе катушки намотаны проводом ПЭВ 0,31. ВЧ катушки приемника — L1 — 9 витков, L2 — 3 витка (L2 наматывается на поверхность L1), L3 — 9 витков. Для намотки использован такой-же провод.

Катушки ПЧ приемника использованы готовые от карманных радиовещательных приемников с промежуточной частотой 465 кгц. Эти катушки взяты вместе со своими контурными конденсаторами.

Передатчик смонтирован на макетной печатной плате и помещен в пластмассовую коробку. В качестве антенны используется стальная проволока диаметром 1 мм и длиной 1М на её концах закреплены две резиновые присоски, которыми она крепится к заднему стеклу автомобиля изнутри.

Сам передатчик подключается только по цепи питания. Если используется охранное устройство, имеющее реле, включающее звуковой сигнал, то питание можно подавать на передатчик через это реле, или подключить его параллельно обмотке реле.

Приемник размещается в малогабаритном пластмассовом корпусе, в авторском варианте в корпусе абонентского громкоговорителя, который
устанавливается на стене в помещении. Антенна — кусок монтажного провода длиной 2 метра, расположенный на деревянном карнизе для штор.

Если автомобиль ставите во дворе со стороны окна, на котором антенна приемника, дальность получается около 300 метров. Для питания приемника используется аккумуляторная батарея 7Д-01 или сетевой источник напряжением 9В.

Установка простой автономной сигнализации своими руками

Охранная сигнализация

Иногда возникает потребность в установке недорогой автономной сигнализации, для защиты от воров. Применение готовых промышленных образцов в таких случаях может быть экономически нецелесообразным.

В этой статье я расскажу про изготовлении и установку простой автономной сигнализации своими руками. Данная сигнализация подойдет для охраны квартиры, дачи или гаража.

Автономные охранные сигнализации

Краткое описание принципа действия: сигнализация такого типа при обнаружении взлома оповещает хозяина квартиры или другого охраняемого помещения и включает громкую сирену. В некоторых случаях оповещение владельца происходит с помощью автоматического звонка или предупреждающего SMS-сообщения.

Что мы хотим от сигнализации

  • Реакция на проникновение, к примеру пассивным ИК датчиком движения
  • Предупреждение о проникновении сиреной. Оповещение должно действовать в течении определенно времени (например 6 мин), после чего выключаться.
  • После срабатывания сигнализации система должна снова возвращаться в дежурный режим ожидания. Если требуется, сигнализация должна срабатывать неоднократно.
  • Низкое потребление тока во время длительной (6 мес.) работы в режиме ожидания.

Чтоб изготовить сигнализацию нам потребуются:

  • Инфракрасный пассивный датчик движения. Например в купленный в OBI датчик – выключатель освещения. Приблизительная цена 300р.
  • Небольшая сирена на 12 вольт. В моем случае была использована модель на 105dB, вы можете использовать любую иную. Цена примерно 200р.
  • Остальные детали: крепление для батареек, реле на 6В,провода, изоляционные трубочки.

Давайте приступим, первое что нам необходимо сделать, это немного модифицировать датчик движения, переведя его с питания 220В на 12В. Быстрый, поверхностный анализ схемы показал, что данная схема может работать при напряжении от 7–8 В до 30 В. При питании 12В нужно поставить реле на напряжение 6В. (12 вольтовое  напряжение не включается).

Теперь давайте вскроем датчик. Если отогнуть одну из опор, то без особых проблем можно извлечь шарообразную часть. Половинки держатся на маленьких креплениях-защелках.

Вытаскиваем плату. Как вы можете видеть на фотографии, датчик представляет собой пассивный инфракрасный приемник, который реагирует на изменение величины инфракрасного излучения на него попадающего и простой оптической системы. Угол обзора этого датчика 180 градусов.

К точкам слева нужно надо подать питание. На «-» отрицательный, на «+» положительный полюс и от источника питания.

К точкам справа мы подключим обмотку реле. Штатное реле (тёмная коробочка) нам необходим0 демонтировать.


Из-за нехватки места внутри шарообразной части датчика, было решено с помощью проводов вывести реле в основание корпуса.

Питание на датчик подается через выключатель. В момент когда срабатывает датчик подается напряжение на обмотку реле. Реле включается и своими замыкающими контактами включат сирену. С помощью реле вы можете подключить не только одну сирену.

Внизу с левой стороны находится реле. Сверху справа наверху выключатель.

 Батареи и сирена подключаются через клеммы.

Охранная сигнализация готова

ВНИМАНИЕ! Не в коем случае не включайте сирену предварительно не защитив уши, несмотря на свой небольшой размер она довольно громкая и может повредить слух.

Вы можете выставить в соответствии с регулятором на датчике движения время работы сирены после срабатывания. Минимум 10 секунд, максимум 8 минут.

Датчик движения можно установить внутри помещения а сирену вывести на улицу. К сожалению после подачи питания срабатывает датчик движения, поэтому было бы правильнее вывести выключатель сирены в скрытое место и включать его через 5 минут после включения датчика движения. Выключатель может коммутироваться ключом, как замок зажигания автомобиля.

Датчик движения получился достаточно экономным. Судя по амперметру:
В режиме ожидания 700 мкА
В режиме срабатывания 1,1 мА
Ток сирены 200мА

Простой подсчет говорит о том, что для работы в течении полу года необходимо 3,1 А*ч. Емкость щелочной батарейки около 2,5 А*ч. Следовательно на зиму нужно 16 щелочных батареек соединенных смешано.

Испытание в морозильной камере показали, что сигнализация работает даже при -33 градусов.

Учитывая наши неспокойные времена и автономность сигнализации, ее можно применять для возведения охранного, защищенного периметра на природе вокруг палатки например. У нас на сайте была еще одна статья, где мы рассказывали о простейшей сигнализации  для вылазок на природу «Как сделать простую сигнализацию своими руками?»

По материалам сайта mind.telent

Простая сигнализация протечки воды | Сделай сам своими руками

Наша жизнь штука непредсказуемая и всегда может произойти то, чего меньше всего ожидаешь. К примеру, может произойти протечка воды, в том месте, которое казалось особо надежным. Чтобы вовремя среагировать и узнать о такой протечке воды из начальных капель – я предложу вам вариант простой сигнализации, которую может сделать каждый из вас своими руками.
Сигнализация не содержит дефицитных деталей, практически не потребляет энергии в дежурном режиме, и одного элемента питания хватит более чем на 3 года. Минимальные размеры позволяют установить прибор в любое место, где необходим контроль.
Это простое и не хитрое устройство поможет вам и в случае протечки даст сигнал. А ваша своевременная информированность позволит вам быстро принять нужные меры (перекрыть кран, вызвать сантехника, и т. п.). Тем самым спасется ваше имущество и, возможно, имущество ваших соседей.

Раз уж речь пошла о соседях, из моего опыта могу сказать, что бывают небольшие протечки, которые себя никак не проявляют (так как находятся в защитных коробах, скрывающих трубы) и в один прекрасный момент на пороге появляется сосед с претензиями…
Данная сигнализация избавит вас от этого и даст вам сигнал о капельной протечке моментально.
И так, нам понадобятся:
  • Батарейка 3 В CR1632 («таблетка»).
    Один транзистор BC517, BC816 или любой другой NPN структуры. Отечественный аналог – кт315, кт3102.
  • Резистор 1-2 мега ома.
  • Зуммер, можно купить тут — aliexpress.

Транзистор выполняет роль чувствительного ключа. А резистор не дает открываться транзистору от разных ложных помех и повышенной влажности. Сенсором сигнализации являются два вывода, при попадании воды, на которые замыкается цепь и срабатывает сигнализация, свидетельствующая о протечки воды.
Схема простая. Спаиваем по схеме.

Я решил собрать все в крышке от пластиковой булки. Отпилил горлышко, посадил все на термоклей. Предварительно произвел проверку сигнализатора.


Устройство не нуждается в настройке и регулировке и начинает работать сразу после подачи питания.

Для более долгой работы можно использовать элементы «АА» или «ААА» («пальчиковая» и «мизинчиковая» батарейки). Тогда сигнализатора хватит лет на 5.
Если же громкость зуммера вам покажется не сильно громкой – замените батарейку на батарейку типа «Крона» с напряжением 9 вольт.
Таких мини сигнализаций лучше делать несколько и расположить их в возможных метах протечки: под стиральной машинкой, в сан узле, за решеткой под радиатором отопления и т.п.
Желаю вам, чтобы у вас никогда не было такого:

Видео сборки устройства:

Всем спасибо!

Разработка индивидуальных цепей сигнализации клеток

Nat Rev Mol Cell Biol. Авторская рукопись; Доступно в PMC 2010 ноя. 8.

Опубликовано в окончательной отредактированной форме AS:

PMCID: PMC2975372

NIHMSID: NIHMS246517

WENDELL A. LIM

HHMI и отдел сотовой и молекулярной фармакологии, UCSF, клетки Лаборатория движения, Центр развития наномедицины NIH, Исследовательский центр синтетической биологии NSF

Wendell A.Лим, HHMI и кафедра клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF, Лаборатория клеточного движения, Центр развития наномедицины NIH, Исследовательский центр синтетической биологии NSF;

См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Живые клетки развили широкий спектр сложных сигнальных реакций, которые позволяют им выживать в различных экологических условиях и выполнять определенные физиологические функции. Наше все более сложное понимание молекулярных механизмов клеточных сигнальных сетей у эукариот выявило удивительно модульную организацию, и биологи-синтетики изучают, как это можно использовать для создания клеток с новым сигнальным поведением. Этот подход начинает раскрывать логику того, как клетки могут развивать новые инновационные функции, и приближает нас к захватывающей возможности создания пользовательских клеток с точными функциями восприятия-реакции, которые могут быть полезны в медицине и биотехнологии.

Ключевые слова: клеточная сигнализация, инженерия, синтетическая биология, терапия, MAP-киназа, скаффолд, модули, белковые взаимодействия, N-WASP, рецепторы, GPCR, Notch, RTK, рак, адоптивная иммунотерапия, химерные антигенные рецепторы, Т-клетки , оптический контроль, биопродукция

Живые клетки представляют собой высокодинамичные системы, использующие сложные молекулярные сигнальные цепи для наблюдения за внешними и внутренними состояниями и для выполнения соответствующих физиологических реакций.Подобно любой сенсорной машине, созданной или созданной человеком, эти клеточные сигнальные цепи содержат подсистемы принятия решений, которые действуют как датчики и процессоры (такие как рецепторы и их нижестоящие эффекторы), которые в конечном итоге контролируют различные ответные подсистемы (такие как транскрипция генов и динамика цитоскелета). ). Основная цель современной клеточной биологии состоит в том, чтобы понять, как эти молекулярные сигнальные системы достигают своих сложных ответов, оптимально настроенных для их физиологической роли. В то время как подавляющее большинство исследований направлено на анализ, картографирование и анализ клеточных сигнальных сетей, наше растущее понимание того, как работают эти системы, привело к появлению радикально нового подхода — усилий по проектированию и созданию пользовательских синтетических сигнальных цепей [1,2]. ].

Общая организация и поведение сотовых сигнальных цепей

a | Клетки обычно воспринимают внешние стимулы через рецепторы и другие датчики . Затем эта информация обрабатывается внутриклеточными сигнальными сетями, которые, в свою очередь, задействуют различные клеточные выходы, включая экспрессию генов, секрецию, изменения цитоскелета и рост клеток.

б| Некоторые из основных проблем в развитии или проектировании новых сигнальных схем : достижение правильной связи конкретных входов и конкретных выходов; настройка количественных характеристик сигнального ответа — доза-реакция и динамика — так, чтобы они были оптимальными для физиологической функции; и создание надежных пространственно самоорганизующихся процессов, таких как процессы, связанные с поляризацией клеток, направленной подвижностью, клеточным делением и компартментализацией клеток.

Здесь мы сосредоточимся на синтетической биологии передачи сигналов и рассмотрим, как можно сконструировать сигнальные схемы эукариотических клеток для создания клеток с заданным сигнальным поведением. Эукариотические клетки используют сети сигнальных белков, чтобы ощущать свое окружение и обеспечивать быстрые ответы. Поскольку сети обработки сигналов в клетках функционируют в трехмерной среде, они также контролируют сложные пространственные или морфологические клеточные ответы. Мы рассмотрим, как могут быть созданы сигнальные цепи с точным ответным поведением, учитывая, как определяется специфичность ответа (то есть, какие наборы выходов связаны с конкретным входом), как точно настроена доза-реакция или временная динамика. профили ответов оптимизированы для определенных физиологических функций, и как может быть достигнут сложный пространственный и морфологический контроль ().Мы также рассмотрим, почему возникли усилия по проектированию и созданию пользовательских синтетических сигнальных цепей, как они могут дать более глубокое представление о принципах и механизмах проектирования молекулярных сигнальных систем и о том, как настраиваемое поведение реакции может быть применено в медицине и биотехнологии. Наконец, мы рассматриваем, как можно было бы разработать будущие инструменты и методы, чтобы упростить разработку клеточного поведения.

Для чего нужна инженерная сигнализация ячеек?

Прежде чем рассматривать конкретные примеры инженерных сигнальных путей, полезно обсудить мотивы инженерии клеточных сигнальных путей.Попытка создать новое сигнальное поведение в клетках может показаться дерзкой и глупой целью, учитывая, что у нас еще нет полного или надежного предсказательного понимания естественных сигнальных цепей клеток. Тем не менее, инженерия сотовой сигнализации — это не просто процесс применения уже хорошо развитого понимания, но и предлагает подход к «пониманию путем построения». В то время как биология традиционно была наукой анализа и деконструкции для выявления генов и молекул, важных для конкретного процесса, синтетическая биология предлагает обратный подход, фокусируясь на том, как отдельные молекулярные части могут быть собраны в системы, которые выполняют сложное поведение. Поскольку в настоящее время у нас есть полностью секвенированные геномы и огромное количество протеомных данных, у нас нет недостатка не в полном списке молекулярных частей, а скорее в понимании того, как эти части сочетаются друг с другом функционально согласованным образом. Разработка новых сотовых сигнальных сетей предлагает нам подход к проверке и расширению нашего понимания принципов организации сложных молекулярных систем.

В этом смысле синтетическая биология передачи сигналов не просто ориентирована на достижение прикладной цели, такой как создание клетки с целевой функцией, но также является исследовательской наукой, в которой важно понять, какие конструкции «работают» , и как они относятся к проектам, которые «не работают».Если, например, у кого-то есть естественная сигнальная сеть, которая осуществляет интересующее сложное поведение, традиционная генетическая деконструкция может быть использована для идентификации молекул и связей, которые необходимы и важны для функции (4). Однако затем синтетические подходы можно использовать для систематического изучения многих типов изменений — альтернативных сетевых связей, настройки силы связи, добавления новых связей — для проверки того, какие сети совместимы с интересующим поведением. Анализируя естественную сеть или создавая единственную успешную схему, вряд ли удастся получить более глубокое понимание функционального ландшафта, которое может дать более полное и систематическое исследование синтетической схемы () [3–5].В этом смысле попытки спроектировать клеточное поведение сродни ранней истории синтетической органической химии, где синтез новых или модифицированных молекул обеспечил дополнительный подход к химическому анализу в развитии фундаментальных теорий химической связи, структуры и реакционной способности. 6]

Зачем переделывать сигнальные цепи сотовой связи?

и | понимание принципов проектирования. Традиционно такие методы, как разрушение генов, используются для анализа сигнальной сети. Синтетические подходы предлагают дополнительную информацию, создавая альтернативные версии сети, которые отличаются как сетевым подключением, так и силой связи. Сопоставляя пространство функциональных (красные кружки) и нефункциональных (синие кружки) вариантов, можно глубже понять функциональные требования.

б | создание дизайнерских сигнальных путей для терапевтических или биотехнологических приложений. Мы надеемся собрать набор сигнальных модулей, которые можно будет использовать для создания ячеек с разработанными сигнальными ответами.Противораковая клетка может обнаруживать комбинацию сигналов опухоли и давать ответы, такие как производство реагентов для визуализации, уничтожение клеток или секреция факторов, нарушающих микроокружение опухоли. Такая ячейка также может иметь предохранительные выключатели, которые при необходимости могут отключить ячейку. Иммуносупрессивная клетка может обнаруживать комбинацию сигналов аутоиммунного ответа или отторжения трансплантата и запускать локальные контрмеры, такие как секреция противовоспалительных цитокинов. Умная клетка биопродукции (ферментации) будет спроектирована таким образом, чтобы точно модулировать поток в путях роста и продукции в ответ на стрессовое состояние клетки, тем самым оптимизируя общий выход.

Изучение пластичности сигнальных путей и способов настройки их функций также имеет отношение к патологии и лечению заболеваний. Многие виды рака содержат онкогенные мутации, которые эффективно «перестраивают» клеточные сигнальные сети, контролирующие баланс между ростом, дифференцировкой и гибелью клеток [7]. 8–10]. Многие белки бактериальных патогенов взаимодействуют с клеточной сигнальной киназой хозяина и регулирующими путями актина, часто для подавления иммунного ответа хозяина или усиления инфекции (см. Дополнительную вставку 1).Таким образом, используя синтетическую биологию для понимания пластичности путей и того, как их поведение изменяется под воздействием сетевых возмущений, мы можем получить лучшую основу для понимания стратегий, которые патогены используют для использования присущей им хрупкости сигнальных сетей. Более того, мы можем разработать стратегии для возврата больной сети к стабильному, непатологическому поведению. Наиболее стабильная сетевая терапия может включать не простое блокирование первичного онкогенного белка лекарством, а перестройку сети таким образом, чтобы она находилась в новой и стабильной области поведенческого пространства.

Применение сконструированной сигнализации в терапии и биотехнологии

Еще одним мотивом инженерии клеточной сигнализации является возможность создания клеток, запрограммированных на выполнение точно разработанных приложений (). Представьте, если бы мы могли имитировать и превзойти эволюцию, используя набор молекулярных частей для генетической инженерии клеток, которые выполняют специально разработанные реакции. По мере развития биологии стволовых клеток [11–12] и развития таких методов, как адоптивная иммунотерапия [13–14], возможность использования клеточной терапии становится все ближе, но для этого потребуется сложная клеточная инженерия для точного контроля поведения клеток. Например, без нового контроля, как могла бы быть направлена ​​правильная миграция и дифференцировка стволовых клеток для регенеративной медицины, учитывая отсутствие нормальных сигналов развития? Более того, по мере того, как в промышленных производственных процессах задействованы биологические организмы (например, производство биотоплива или материалов) [15], может появиться возможность создавать более умные производственные штаммы, которые, подобно макроскопическим производственным объектам, имеют клеточные системы управления, которые отслеживают внешнее и внутреннее состояние для оптимизации. производство.Это может быть особенно важно, поскольку мы требуем, чтобы организмы брожения, такие как дрожжи, производили широкий спектр материалов, которые могут оказывать токсическое воздействие.

Разработаны противораковые клетки

Если мы сосредоточимся на разработке индивидуальных терапевтических клеток, которые могут воспринимать сигналы болезни и выполнять целенаправленные и точно откалиброванные терапевтические программы, какое поведение мы бы хотели? Иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты или клетки-естественные киллеры, могут быть модифицированы для выявления и уничтожения опухолевых клеток. Такие клетки уже можно забирать у пациентов, генетически модифицировать, размножать ex vivo и адоптивно переносить обратно пациенту [16–17]. Противораковая клетка может быть разработана для обнаружения комбинации сигналов, связанных с опухолью, включая специфические опухолевые антигены, гипоксию, органоспецифические антигены, а также специфические факторы роста и цитокины, которые секретируются опухолями, чтобы уклониться от нормальных иммунных ответов и создать опухоли, способствующей микроокружению [18]. Инженерные клетки, которые распознают эти факторы, но связаны с противоопухолевым ответом, были бы идеальным вариантом.Также очень важно внедрить в эти терапевтические клетки внешний контроль (например, малую молекулу) или предохранительные переключатели, чтобы их поведение можно было отключить или ослабить в ответ на нежелательные побочные эффекты или оттитровать величину их реакции.

Разработанные клетки, которые обнаруживают эти специфические для опухоли входные данные, могут быть сконструированы таким образом, чтобы они давали ряд различных ответов, таких как продукция визуализирующих агентов, помогающих идентифицировать опухоли и метастазы, и контроль реакций эндогенных иммунных клеток, таких как хемотаксис, фагоцитоз и убийство клеток. Возможно, наиболее важно то, что эти терапевтические клетки могут быть запрограммированы на секрецию факторов, нарушающих локальное микроокружение опухоли, таких как провоспалительные цитокины и факторы, препятствующие ангиогенезу, что делает ее непригодной для устойчивого роста опухоли. Это было бы эквивалентно созданию специальной иммунной клетки, которая отключает опухолевые клетки и микроокружение на нескольких уровнях.

Направленная иммуносупрессия

Иммунная клетка также может быть сконструирована для блокирования аутоиммунного заболевания или отторжения трансплантированных органов.Обычная иммуносупрессивная лекарственная терапия имеет обширные и серьезные системные эффекты. Сконструированную клетку можно запрограммировать на локальную иммуносупрессивную реакцию, возможно, в ответ на специфические аутоиммунные или трансплантационные антигены в сочетании с цитокиновыми сигнатурами сильного аутоиммунного ответа. Такие клетки могут быть запрограммированы на хемотакс в местах этих сигналов и отвечать секрецией противовоспалительных цитокинов, которые отключают воспалительные петли положительной обратной связи, которые обычно приводят к полномасштабному аутоиммунному ответу или реакции отторжения.

Несмотря на то, что разработка индивидуальных терапевтических клеток находится в будущем, полезно подумать о том, какое поведение обнаружения и реагирования будет ценным, поскольку они обеспечивают полезные целевые вехи в разработке инструментов и стратегий для клеточной перестройки.

Можно ли проектировать сети сотовой сигнализации?

Существуют большие разногласия относительно того, можно ли на самом деле сконструировать клетки. Являются ли клеточные сигнальные системы настолько тонко оптимизированными, что наше вмешательство приведет к катастрофическим сбоям, или настолько надежно спроектированными эволюцией, что добавление новых генов и сетевых связей не сможет существенно изменить их функцию? Ясно, что эволюция смогла перемонтировать сигнальные пути клеток, чтобы они давали разнообразные ответы — на каком-то уровне они относительно пластичны и эволюционируют.Таким образом, прежде чем пытаться спроектировать новое клеточное поведение, может быть полезно рассмотреть, как эволюция может достичь новых инновационных функций.

Отличительной чертой сигнальных белков, которые, как считается, играют важную роль в эволюции, является их модульная структура. Они почти всегда состоят из множества модульных доменов, некоторые из которых выполняют каталитическую функцию, а многие из них имеют специфические регуляторные или интерактивные функции [19, 20]. В разных сигнальных белках эти модульные домены обнаруживаются в весьма разнообразных комбинациях.Это привело к модели, согласно которой разнообразие сигнальных функций может развиваться посредством рекомбинации этого набора доменов. Таким образом, в принципе, если бы мы могли понять, как эволюция работает с этими модулями, мы могли бы использовать тот же набор инструментов для поиска областей пространства поведения, которые, насколько нам известно, эволюция еще не исследовала.

Почему сигнальные белки и системы настолько модульны? Большинство согласны с тем, что в эволюционном масштабе организмы находятся под давлением приспособленности, чтобы развивать инновационные клеточные сигнальные реакции, которые могут привести к преимуществам в меняющихся условиях и по сравнению с конкурирующими организмами. Под таким изменяющимся давлением фитнеса модульные системы могут спонтанно развиваться как способ способствовать более быстрому разнообразию функций [21]. Алон и его коллеги смоделировали эволюцию биологической сети, используя эволюционные алгоритмы для поиска простых вычислительных сетей, решающих поставленную задачу [22]. Когда они неоднократно меняют целевую цель, в результирующих сетях спонтанно развиваются более модульные решения — сети, в которых есть функциональные подсети. Эти предварительно сформированные подсети — модули — могут быть быстро пересоединены новыми способами для перехода от одной целевой функции к другой.По сути, кажется, что модули обеспечивают способ быстрого перемещения из одного функционального пространства в другое, перепрыгивая через обширные области нефункционального сетевого пространства. Таким образом, модульная организация сигнальных белков и сетей может отражать давление на эти системы, чтобы генерировать поведение, соответствующее потребностям постоянно меняющейся среды.

Важность модульности в содействии эволюции новых функций согласуется с концепциями эволюции и развития, в которых утверждается, что большая часть разнообразия функций и морфологии организмов развивается за счет альтернативного регулирования существующих компонентов, а не за счет изобретения принципиально новых компонентов [23].Хотя многие из этих идей были разработаны с упором в первую очередь на регуляцию генов различными цис-действующими модулями, они также могут применяться к регуляции ключевых каталитических сигнальных модулей с помощью различных локализационных и регуляторных модулей [24,25]. Неудивительно, что многие попытки сконструировать новое сигнальное поведение, описанные ниже, используют стратегии рекомбинации модульных функциональных единиц новыми способами, таким образом, в действительности используя эволюционную стратегию для разработки новой функции.

Разработка новых сенсорных систем

Одним из наиболее важных инструментов для перепрограммирования клеточного поведения будет способность создавать новые сенсоры и рецепторы для целевых входов. Однако, это, возможно, наименее охарактеризованный элемент в инженерии клеточной передачи сигналов, т.к. вселенная возможных входных сигналов очень обширна и часто требует работы с относительно сложными ассоциированными с мембраной мембранными белками. Ниже мы описываем недавний прогресс в модификации или конструировании различных молекул рецепторов.

Перенаправление вывода естественных рецепторов

Естественные рецепторы, которые обнаруживают специфические эндогенные входы, могут быть сконструированы таким образом, чтобы генерировать неестественный выходной отклик.Есть несколько примеров того, как нативный рецептор перенаправляется, чтобы вызвать новый ответ транскрипции. Один из таких подходов использует модульную структуру рецепторного белка Notch. Notch представляет собой трансмембранный рецептор, который обнаруживает дельта-белок, присутствующий на соседних клетках, — критический канал межклеточной коммуникации в развитии и дифференцировке. Когда Delta связывает Notch, трансмембранная область Notch расщепляется мембранной протеазой, высвобождая С-концевой домен Notch в цитоплазму. Этот домен может проникать в ядро ​​и активировать транскрипцию генов. Struhl et al показали, что этот модуль фактора транскрипции рецептора Notch может быть заменен синтетическим фактором транскрипции (Gal4-AD), так что при активации in vivo этот химерный рецептор Notch может активировать гены, на которые нацелен новый фактор транскрипции [26]. ,27]. Хотя эта конструкция использовалась в качестве репортера для активации Notch, ее можно было легко использовать для связывания обнаружения нативного дельта-лиганда с совершенно новым набором ненативных генов-мишеней.

Barnea et al. расширили эту вдохновленную Notch модульную стратегию, разработав новые транскрипционные выходы для других рецепторов, которые обычно не используют этот тип механизма активации протеаз [28]. Когда рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), активируются их специфическими лигандами, они часто рекрутируют β-аррестин, который участвует в подавлении передачи сигналов GPCR. Barnea et al. объединили аррестин с высокоспецифичной протеазой вируса гравировки табака (TEV), так что он был рекрутирован совместно с активированными GPCR. Синтетический фактор транскрипции также был слит с цитоплазматическим хвостом GPCR, связанным сайтом расщепления TEV. Таким образом, когда сконструированный слитый белок GPCR активируется его эндогенным лигандом, он рекрутирует партнерскую протеазу аррестин-TEV, которая расщепляет и высвобождает домен транскрипционного фактора из GPCR, посредством чего он может входить в нуклеазу и активировать гены-мишени. Эта система была успешно использована для связывания новых транскрипционных репортеров с активацией широкого спектра специфических GPCR.Ответ очень специфичен из-за специфичности расщепления TEV. В принципе, эту стратегию можно использовать для связывания любого эндогенного сигнала, опосредованного GPCR, с экспрессией желаемых генов-мишеней.

Barnea et al. также использовали эту стратегию, чтобы связать передачу сигналов эндогенной рецепторной тирозинкиназы (RTK) с новыми выходами транскрипции [28]. Большинство RTK при стимуляции активируют свои киназные домены, которые опосредуют аутофосфорилирование цитоплазматических тирозинов для рекрутирования белков, содержащих домен Sh3. Здесь протеаза TEV была слита с рекрутированными доменами Sh3, а синтетический транскрипционный фактор был слит с цитоплазматическим хвостом RTK через сайт расщепления протеазой TEV. Таким образом, активация RTK приводит к рекрутированию слияния Sh3-домен-TEV, высвобождению рецептор-ассоциированного фактора транскрипции и транскрипции сконструированного гена. Примечательно, что эта простая модульная стратегия может быть применена к нескольким классам рецепторов, если они рекрутируют специфический белок-партнер при активации.

Howard et al. использовали модульность передачи сигналов RTK для перенаправления онкогенного сигнала роста на апоптотический ответ [29]. Они разработали новый адаптерный белок Sh3, в котором домен Sh3, распознающий активированный RTK, был слит с эффекторным доменом смерти от Fadd. Таким образом, активация RTK приводила к рекрутированию мембраны домена смерти, что индуцировало ответ клеточной смерти. Возможность увязки других новых результатов с этими ключевыми мероприятиями по найму изучена недостаточно.

Рецепторы, которые обнаруживают новые входные сигналы малых молекул

Вышеуказанные стратегии сосредоточены на способах использования рецепторов, которые обнаруживают эндогенные сигнальные молекулы, и модификации их для получения новых ответов. Однако во многих случаях для клеточной инженерии могут потребоваться рецепторы, обнаруживающие новые сигналы, для которых не существует эндогенных рецепторов. Эти новые сигналы включают небольшие молекулы, которые мы можем захотеть обеспечить внешним управлением инженерной системой.

Относительно хороший успех был достигнут в использовании GPCR в качестве платформы для создания малых молекулярных рецепторов, контролируемых.Некоторые GPCR, такие как опиоидные рецепторы, могут активироваться их эндогенными лигандами и специфическими низкомолекулярными агонистами. Конклин, Рот и его коллеги разработали молекулы, известные как рецепторы, активируемые исключительно синтетическими лигандами (RASSL) [30,32]. Эти рецепторы мутированы таким образом, что они не могут связываться со своим эндогенным лигандом, но активируются и вызывают свой эндогенный нижестоящий эффект в ответ на небольшую, фармакологически инертную молекулу-агонист.

GPCR различаются по своей продукции, отчасти потому, что отдельные рецепторы взаимодействуют со специфическими гетеротримерными G-белками.Дальнейшая инженерия привела к появлению версий RASSL, которые специально связаны с каждым из этих отдельных нижестоящих путей, что позволяет небольшим молекулам контролировать весьма разнообразный набор выходных данных. Эти RASSL были успешно применены на трансгенных мышах — по сути, перепрограммируя передачу сигналов в полноценном живом организме — в основном в качестве диагностического и аналитического инструмента. Применение было разнообразным, учитывая широкое использование GPCR в различных тканях. Например, мыши, несущие вкусовые нейроны, экспрессирующие RASSL, проявляли специфические сладкие (аттрактивные) или горькие (отталкивающие) реакции на воду, смешанную с агонистом (спирадолином), в зависимости от того, в каком типе нейронов они экспрессировались [33].Кроме того, экспрессия RASSL в клетках сердца позволяла контролировать частоту сердечных сокращений путем введения спирадолина [34]. То, что эти рецепторы работают так надежно in vivo , намекает на их потенциальную полезность в более сложной клеточной инженерии.

Химические димеризаторы представляют собой еще одну стратегию для достижения контроля малых молекул над передачей сигналов. Такие стратегии были рассмотрены в другом месте [35,36] и не будут обсуждаться здесь.

Рецепторы, обнаруживающие указанные пользователем антигены

Было бы идеально разработать рецепторы, способные обнаруживать ассоциированные с заболеванием антигены, такие как белок, сильно экспрессирующийся в опухоли или инфекционном агенте.Если бы рецепторы можно было сконструировать для достижения того же разнообразия и селективности распознавания, что и антитела, можно было бы обнаружить широкий спектр входных сигналов и связать их со специфическими ответами. Химерные антигенные рецепторы (CAR) — рецепторы, разработанные с одноцепочечными антителами (scFv) как часть их механизма обнаружения, — были разработаны именно как этот тип многоцелевой структуры. Эта стратегия проистекает из модульности рецепторов иммунных клеток, таких как рецептор Т-клеток. Хотя Т-клеточный рецептор представляет собой сложный мультибелковый комплекс, перекрестного связывания цитоплазматической области субъединицы дзета-цепи CD3 достаточно, чтобы индуцировать передачу сигналов Т-клетками [37].Дзета-цепь CD3 содержит мотивы, которые фосфорилируются при активации тирозинкиназами, такими как Lck, чтобы вызвать рекрутирование белков, содержащих домен Sh3, таких как киназа ZAP-70. Слияние цитоплазматической области дзета-цепи CD3 с внеклеточным одноцепочечным антителом (scFv) дает рецептор, часто называемый «Т-телом», который при экспрессии в Т-клетках приводит к целенаправленному уничтожению клеток, экспрессирующих распознанный антиген (предположительно поверхностные антигены сшивают и активируют химерные рецепторы) [38,39].Слияние scFv с внутриклеточной областью рецептора Fc (гамма-цепь) может дать сходный тип химерного антиген-чувствительного рецептора. Эти исследования подчеркивают модульность этих рецепторов: связь нового внеклеточного элемента распознавания с нижестоящими внутриклеточными сигнальными элементами приводит к новому датчику ввода/вывода.

Эти CAR первого поколения относительно примитивны и имеют неоднозначные результаты. Т-клетки, экспрессирующие CAR, направленные на опухолевые антигены, обладают умеренной сигнальной способностью по сравнению с ответами эндогенных TCR, умеренно пролиферируют ex vivo и in vivo и плохо выживают при повторном воздействии антигена [16,17]].Улучшения в этом поведении были достигнуты за счет включения дополнительных модульных доменов во внутриклеточные области CAR, включая домены из молекул корецепторов, которые являются частью нормальной активации TCR, что, возможно, имитирует более полную активированную внутриклеточную сборку [40,41]. Клетки с этими CAR следующего поколения более эффективно контролируют ксенотрансплантатные опухоли у мышей и в настоящее время переносятся на клинические испытания [16]. Более сложная инженерия CAR может привести к дальнейшему улучшению терапевтической функции.

Сенсоры, обнаруживающие физические сигналы, такие как свет

Еще одна интересная область исследований — разработка генетически закодированных сенсоров, способных обнаруживать свет и преобразовывать его в специфическую биологическую реакцию. Эта область называется оптогенетикой. Встречающиеся в природе светочувствительные белки растений, водорослей и бактерий могут быть модифицированы для использования в высших организмах, включая млекопитающих. Эти инструменты чрезвычайно полезны в качестве пространственно-временных циферблатов для контроля и анализа сложного клеточного и организменного поведения, особенно когда они экспрессируются из промоторов, специфичных для клеточного типа.В долгосрочной перспективе оптогенетические инструменты могут быть использованы для дистанционного управления клетками, используемыми в терапевтических целях, хотя существуют серьезные технические проблемы, такие как доставка света в организм, которые необходимо будет преодолеть. В настоящее время наиболее часто используемыми инструментами оптогенеза являются белки микробного канала родопсин и галородопсин, которые широко используются для контроля функции нейронов. Они рассмотрены в другом месте [42] и здесь подробно обсуждаться не будут.

Совсем недавно появились дополнительные оптогенетические инструменты, которые можно применять к более широкому спектру клеточных сигнальных систем. Airan et al. сконструировали набор активируемых светом GPCR, которые могут взаимодействовать как с нижележащими Gs, так и с Gq гетеротримерными G-белками [43]. Были созданы химеры светочувствительной зрительной системы GPCR, родопсин (бычий), содержащие внутриклеточные петли как от Gq, так и от Gs-связанных адренорецепторов. Эндогенная молекула сетчатки представляет собой светочувствительный хромофор. Эти новые инструменты значительно расширяют сигнальный «словарь», которым можно управлять с помощью света, учитывая важность сигнальных путей Gq и Gs в различных типах клеток.

Еще более общая стратегия управления светом включает использование управляемых светом белковых взаимодействий. Временное взаимодействие специфических белков-партнеров является основой многих внутриклеточных сигнальных событий (см. ниже), и рецепторы могут быть обойдены, так что свет непосредственно контролирует такие внутриклеточные взаимодействия. Levskaya et al. использовали полученную из растений систему взаимодействия Phytochrome — связывание этого фоторецептора с его партнерским доменом PIF может включаться и выключаться с помощью определенных длин волн света — для привлечения специфических белков к мембране точным пространственно-временным образом [44]. В случае факторов обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), которые контролируют ГТФазы Rho-семейства, это можно использовать для запуска активации ГТФазы и последующих изменений цитоскелета, что приводит к светоуправляемому выпячиванию клеток. Хотя этот метод является мощным и потенциально применимым ко многим сигнальным взаимодействиям, система Phy-PIF требует добавления проницаемого для клеток хромофора, который не является эндогенным для клеток млекопитающих. Wu et al. использовали фоточувствительный домен LOV (свето-кислород-напряжение) (обнаруженный в растениях, водорослях и бактериях) для конформационной окклюзии Rac GTPase контролируемым светом способом [45].Этот flavin-связывающий домен обеспечивает еще один потенциально общий элемент конформационного контроля света, который может быть связан для контроля различных сигнальных белков.

Инженерные системы обработки сигналов

В конечном счете, клетки решают, какие программы реагирования выполнять, основываясь на внутриклеточных сигнальных сетях, которые получают и обрабатывают сигналы от сенсорных молекул (см. выше). Недавняя работа в области сотовой инженерии была сосредоточена на понимании того, как эти сети функционируют для принятия решений, и как их можно перенастроить.

Модульная логика обработки сигналов

Внутриклеточные сигнальные белки имеют высокую модульность (см. выше). Большинство модулей делятся на два класса (). К первому классу относятся ферментативные домены, такие как киназы и фосфатазы, которые катализируют посттрансляционные модификации или конформационные изменения, посредством которых хранится информация. В большинстве случаев эти каталитические домены идут парами: ферменты-«писатели» (например, киназы) производят модификацию, а ферменты-«стиратели» (например, фосфатазы) удаляют модификацию.Второй класс представляет собой регуляторные домены или домены взаимодействия, которые модулируют активность каталитических доменов или нацеливают их на определенных партнеров или сайты в клетке. Эти модули могут обеспечивать специфические белок-белковые взаимодействия (либо конститутивные взаимодействия, либо те, которые зависят от посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование) или белок-мембранные взаимодействия. Таким образом, именно домены регуляции и взаимодействия определяют, когда и где активируются каталитические домены и каким партнерам они передают информацию [5].

Модульная логика компонентов внутриклеточной сигнализации

a | ферментативные и регуляторные домены . Модульные эукариотические сигнальные белки обычно состоят из ферментативных доменов и доменов локализации. Ферментативные домены, такие как киназы и фосфатазы, а также GEF и GAP, катализируют регуляторные модификации, такие как фосфорилирование и активация GTPase, соответственно (ферментативные домены часто входят в пары «записывающих» и «стирающих», которые обладают противоположной активностью).Эти ферментативные домены регулируются и направляются доменами взаимодействия, включая домены белок-белкового взаимодействия, домены взаимодействия с мембраной или трансмембранные домены.

б | различных классов многодоменных архитектур . Ферментативные домены могут быть непосредственно нацелены на конкретные субстраты, партнеров или субклеточные местоположения с помощью доменов взаимодействия. В качестве альтернативы они могут быть косвенно нацелены через адаптеры или каркасные белки, которые содержат несколько доменов взаимодействия.Домены взаимодействия также могут аллостерически регулировать каталитические домены, участвуя во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях. Такие белки-переключатели могут активироваться конкурирующими лигандами, которые ослабляют аутоингибирование.

Эти разные классы модулей обнаруживаются в разнообразных комбинациях и расположениях в сигнальных белках (1). Каталитические домены, слитые с доменами-мишенями, могут быть рекрутированы в специфические комплексы или участки мембраны, где они будут модифицировать специфические мишени; часто эти каталитические домены имеют высокую внутреннюю константу Михаэлиса (Km) и, таким образом, требуют нацеливания дополнительными доменами взаимодействия для эффективного катализа. Иногда эти направляющие взаимодействия регулируются, если, например, взаимодействие зависит от посттрансляционной модификации, такой как нацеливание белков домена Sh3 на автофосфорилированные сайты pTyr на активированных RTK. Белки с двумя доменами взаимодействия могут действовать как адаптеры, которые переводят одно взаимодействие во второе, что приводит к увеличению гибкости ответа в зависимости от адапторных белков, которые экспрессируются в конкретном типе клеток. Белки с множественными доменами взаимодействия также могут функционировать как каркасные белки, которые организуют несколько белков на пути в комплекс.Эти взаимодействия могут быть конститутивными или предварительно сформированными, или индуцированными такими факторами, как фосфорилирование, или конформационными изменениями, открывающими сайты взаимодействия. Т.о. каркасные белки могут, в принципе, определять проводные связи сигнальных белков, а также контролировать, когда и где происходит передача сигналов [24, 20].

Вторая важная роль взаимодействующих и регуляторных доменов заключается в непосредственном контроле активности каталитических доменов. Во многих случаях домены взаимодействия участвуют во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях, которые стерически закупоривают каталитический домен или конформационно нарушают его — тип регуляции, называемый модульной аллостерией [46].Связывание конкурирующих межмолекулярных лигандов с доменами взаимодействия индуцирует каталитическую активность белков. Часто множественные домены взаимодействия участвуют в аутоингибировании каталитического домена кооперативным или иерархическим образом [47,48]. Эти белки могут функционировать как сложные переключатели с несколькими входами, которые требуют определенной комбинации входов для правильной активации. Кроме того, поскольку внешние лиганды активируют эти белки, локализация (управляемая этими взаимодействиями) может быть напрямую связана с активацией.

Разработка новых белковых переключателей

Лим и его коллеги исследовали, можно ли использовать модульную аллостерическую логику многих естественных эукариотических сигнальных белков для создания новых сигнальных переключателей путем рекомбинации доменов (10). В самом деле, каталитические домены регуляторного белка актина N-WASP и Rho-семейства GEF могут быть связаны с новыми аутоингибирующими доменами с образованием белков, активность которых контролируется новыми лигандами [49,50]. Внутримолекулярное связывание любого из этих каталитических доменов с доменом PDZ и пептидом-лигандом PDZ может привести к переключению, которое активируется конкурирующим пептидом PDZ.Точно так же несколько доменов взаимодействия могут быть добавлены, чтобы получить комбинаторный переключатель, который отображает управление логическим элементом И. В зависимости от точной конфигурации доменов и внутримолекулярных взаимодействий типы регуляции могут быть разными в ответ на разные конкурирующие внешние лиганды — один лиганд может активировать белок, а другой его репрессировать. Эти типы разнообразных отношений между регуляторными доменами напоминают разнообразное поведение, наблюдаемое у природных сигнальных белков, подтверждая представление о том, что этот тип архитектуры переключателей облегчает эволюцию разнообразных комбинаторных регуляторных переключателей [48]. Dueber et al также показали, что синтетические аутоингибирующие переключатели, использующие многовалентные взаимодействия одного и того же типа, приводят к переключателям, поведение активации которых может быть настроено от линейного к цифровому ответу [51].

Технические схемы обработки сигналов

и | сконструированные аллостерические белковые переключатели . Dueber et al [49,51] показали, что аллостерическая регуляция сигнального белка N-WASP может быть перепрограммирована путем рекомбинации каталитического домена из N-WASP с различными комбинациями взаимодействующих доменов.Новое поведение включало управление с несколькими входами (И-гейт) и очень совместную активацию, подобную переключателю.

б | с использованием каркасных белков в качестве молекулярной платы для изменения выходного сигнала . Связь входа/выхода киназного пути MAP в дрожжах может быть перенаправлена ​​с помощью сконструированного химерного каркаса, который собирает новую комбинацию киназ [58]. Новые сайты взаимодействия также могут быть присоединены к скаффолдам, чтобы задействовать дополнительные модулирующие факторы.Эти дополнительные факторы могут создавать синтетические петли обратной связи, которые можно использовать для создания путей, демонстрирующих разнообразную динамику передачи сигналов [62].

Каркасные белки как молекулярные печатные платы

Внутриклеточные сигнальные цепи также могут напрямую контролироваться путем использования регуляторных взаимодействий для перестройки соединений путей. Например, каталитический домен киназы семейства Src, Hck, который в норме регулируется доменами Sh3 и Sh4, может быть слит с доменом PDZ и направлен in vivo на специфическое фосфорилирование субстратов с мотивом лиганда PDZ [52].

Каркасные белки также можно использовать для создания новых взаимосвязей входа и выхода пути. У дрожжей существует несколько функционально различных митоген-активируемых белковых (MAP) киназных путей, которые регулируют ответы на феромоны спаривания и осмотический стресс [53,54]. Эти пути имеют общие киназные компоненты, но остаются специфичными, поскольку каждый путь организован отдельным каркасным белком [55-57]. Химерный каркасный белок, который организует избранных участников путей спаривания и осмотического стресса, дает неестественный путь, в котором феромон спаривания специфически индуцирует программу ответа на осмостресс в vivo [58].Подобные ковалентные слияния, которые, подобно скаффолду, усиливают взаимодействие между двумя сигнальными белками, могут быть использованы для усиления передачи сигнала по одному пути [59].

Совсем недавно было показано, что каркасные белки не только опосредуют линейные отношения входа/выхода путей, но также координируют рекрутирование модулирующих факторов, которые формируют зависимость от дозы и динамику ответа пути [60,61]. Вдохновленные этими природными примерами, Bashor et al показали, что каркас дрожжевой MAP-киназы спаривания, белок Ste5, можно использовать в качестве молекулярной платы для гибкого изменения количественного поведения реакции спаривания [62]. Слияние дополнительного сайта синтетического взаимодействия с каркасом Ste5 (с использованием пары гетеродимеров лейциновой молнии) облегчает рекрутирование новых модуляторных факторов, таких как фосфатаза MAPK, которая подавляет ответ пути. Однако, если экспрессия и рекрутирование фосфатазы связаны с выходным сигналом пути, создается петля отрицательной обратной связи, которая приводит к адаптации — временной реакции, за которой следует автоматический возврат к более низким уровням выходного сигнала, что является ключевым поведением во многих биологических сенсорных системах.По-разному связывая модуляторы положительного и отрицательного пути, этот небольшой набор управляющих элементов каркаса можно использовать для генерирования весьма разнообразного дозозависимого и динамического поведения, включая высококооперативное переключение, отсроченные ответы, ускоренные ответы и генерацию импульсов. Эти исследования показывают, как организующие центры, такие как скаффолд, являются богатой платформой для обработки и формирования внутриклеточной передачи сигналов либо посредством эволюции, либо путем инженерии.

Разработка пространственной самоорганизации

Одним из наиболее плохо изученных аспектов клеточной передачи сигналов является то, как цепи, состоящие из диффундирующих молекул, могут привести к высокоточной пространственной организации в клетке, такой как направленная поляризация и миграция.Этот тип самоорганизации является аспектом схемы управления, где нет хороших электронных или инженерных аналогов, и где биология может научить инженерию.

Инженерные принципы применяются для понимания механизма поляризации у почкующихся дрожжей S. cerevisae . Поляризация контролируется GTPase Cdc42, которая в конечном итоге локализуется в одном месте на материнской клетке, что приводит к образованию единственной почки, которая прорастает в дочернюю клетку [63].Примечательно, что этот процесс приводит к формированию одиночной почки почти со 100% надежностью. Цепь положительной обратной связи, включающая Cdc42 GTPase, является ключевой в поляризации: активный Cdc42 на мембране рекрутирует цитоплазматический белок GEF Bem1, который активирует и локализует дополнительный Cdc42 [64]. В то время как этот вид петли обратной связи приводит к образованию очагов Cdc42, быстрая диффузия и перераспределение Bem1 между конкурирующими очагами может быть важным, чтобы позволить одному очагу стать доминирующим, что приводит к сингулярности почкования.Был проанализирован эффект замедления диффузии и перераспределения Bem1 путем связывания его с трансмембранным мотивом [65]. Связанный с мембраной Bem1 может спасти летальность нокаута Bem1, но не может подвергаться диффузии в цитоплазме. Вместо этого он доставлялся к плазматической мембране в везикулах через актиновые кабели (также координируемые очагами Cdc42) и удалялся от очагов мембраны посредством эндоцитоза и, таким образом, перераспределялся намного медленнее. Наблюдались серьезные дефекты сингулярности, такие как множество устойчивых конкурирующих фокусов Cdc42, а частота многозачаточных клеток увеличивалась до ~ 5%.Подобные исследования помогают выявить требования к точно контролируемой пространственной самоорганизации и предполагают, что мы можем научиться создавать сигнальные цепи, которые производят индивидуальные пространственные результаты с важным терапевтическим поведением (например, регенеративная медицина, которая требует особой клеточной морфологии и ориентации).

Создание предсказуемой инженерии сигнальных систем

Вышеупомянутые исследования показывают, что сигнальные системы являются в высшей степени модульными и пластичными, а рекомбинация модулей, особенно каталитических доменов с новыми регуляторными доменами, может привести к различным ответным реакциям.Таким образом, вопрос больше не в том, можно ли спроектировать сигнальные системы для получения нового поведения, а в том, можно ли их спроектировать таким образом, чтобы мы могли предсказать, какое поведение возникнет, и насколько успешной будет каждая разработанная схема.

Проблема непредвиденных перекрестных помех

Одна из основных проблем инженерной сигнализации ячеек заключается в повторном использовании естественных компонентов — набора доступных доменов, что может привести к непредвиденным перекрестным помехам. Будут ли взаимодействия, которые вы создаете, приводить к специфическому фосфорилированию желаемого белка, или же используемый домен также будет перекрестно взаимодействовать с другими мишенями, конкурентно титруя важные физиологические взаимодействия и приводя к непредвиденным эффектам или отказу разработанной схемы? Часто естественные части не обладают абсолютной специфичностью, и эволюция, скорее всего, использует сложные сети перекрестной реактивности для обеспечения важной скоординированной регуляции. Хотя такая сложная система, похожая на нейронную сеть, может обеспечить преимущества для клетки, она является анафемой для предиктивной инженерии.

Представление набора инструментов для сигнализации будущего

Одним из решений этой проблемы является сборка набора компонентов, специально оптимизированных для проектирования. Этот вопрос важен для любого типа сигнальной части, но мы сосредоточимся на том, как собрать полезный инструментарий частей, взаимодействующих с белками (4).

Улучшение инструментария для предсказуемой инженерии клеточной сигнализации: части ортогонального взаимодействия

Нативная клетка имеет свой собственный естественный набор модулей взаимодействия с белком, и поэтому сложно разработать новые функции с использованием связанных модулей взаимодействия, которые могут демонстрировать непреднамеренные и непреднамеренные перекрестные помехи в клетке.Оптимизированный набор взаимодействующих частей может значительно повысить предсказуемость сотовой инженерии, устранив вероятность непреднамеренных перекрестных помех. Несколько стратегий оптимизации включают разработку модулей взаимодействия, использующих неиспользованную специфичность; проектирование составных многодоменных взаимодействий; объединение модулей взаимодействия с новым субклеточным нацеливанием; и импорт ортогональных модулей взаимодействия (синтетически сконструированных или полученных из других организмов), которые не обнаружены в клетке-хозяине.

Хотя природа неоднократно использовала семейства частей, такие как домены взаимодействия определенного типа, недавние исследования показывают, что в некоторых случаях члены семейства содержат неиспользуемые сайты узнавания внутри этих доменов. Их можно использовать для создания пар домен-пептид, которые одновременно оптимизированы для взаимодействия с их правильным партнером, избегая при этом перекрестного взаимодействия с другими членами семейства [66,67]. На самом деле были сконструированы пары PDZ домен-лиганд и пары гетеродимеризующихся лейциновых застежек, которые оптимизированы для предотвращения перекрестной реакции с природными доменами того же типа [68,69]. Избирательность и предсказуемость существующих доменов взаимодействия также можно улучшить, разработав составные взаимодействия. Безусловно, многодоменное сотрудничество является естественным механизмом повышения специфичности. Но новым поворотом в этом является проектирование сложных взаимодействий двух доменов-раскладушек. Koide et al. взяли домен PDZ и слили его с доменом фибронектина [70]. Используя фаговый дисплей, они отобрали варианты этого тандемного домена, которые связывают специфический пептид, так что он оказывается зажатым между двумя доменами.Значительно увеличенная площадь поверхности распознавания приводит к взаимодействиям с гораздо более высокой специфичностью и сродством. Другое решение специфичности, наблюдаемое в природе, — дифференциальная компартментализация. Если мотивы нацеливания могут быть использованы для локализации белков-партнеров в специфических органеллах или клеточных местах, то мотивы взаимодействия, вероятно, будут функционировать более специфическим образом, особенно если в этом месте или органелле происходит мало или совсем нет конкурирующих взаимодействий этого типа.

Альтернативным подходом к достижению надежной специфичности является импорт доменов из других организмов, не существующих в конструируемом хозяине. Например, домены PDZ могут быть импортированы в дрожжи (у которых отсутствует большинство таких доменов), хотя нельзя исключать возможность случайных перекрестно реагирующих партнеров [58]. Примером ортогональной молекулярной системы, которая была успешно перенесена на нового хозяина, является бактериальная система рекомбиназы Cre-Lox, которая надежно используется для создания сложных хромосомных перестроек в сложных организмах, включая мышей [71].

Таким образом, представляя себе набор инструментов будущего, может потребоваться набор примерно из десяти пар взаимодействия белков, оптимизированных для конкретного выбранного организма (например, E.coli , S.cerevisae , млекопитающие). в том, что они ортогональны, то есть, как известно, не реагируют перекрестно с протеомом хозяина или белками в наборе инструментов, за исключением родственного им лиганда. Также важно, чтобы эти взаимодействия можно было настраивать, поэтому идеальной была бы серия лигандов для каждого домена взаимодействия, которые различаются по аффинности на несколько порядков.Это позволило бы систематически исследовать, как близость к рекрутированию изменяет поведение системы.

Комбинаторный дизайн против предсказания

Еще один отличный, но все же дополняющий подход к предсказуемой инженерии клеточных сигналов заключается в использовании комбинаторной изменчивости. В естественной эволюции рекомбинация сигнальных модулей для создания новой функции, по-видимому, не была спроектирована или управлялась, а скорее была относительно случайной, и именно естественный отбор определил события перепрограммирования, которые привели к преимуществам приспособленности.Таким образом, очень плодотворным подходом, учитывая отсутствие предсказуемости в клеточной инженерии, может быть создание комбинаторных библиотек синтетических цепей и выбор желаемой функции [25,72]. Более того, этот подход можно комбинировать с полу- предиктивное проектирование, при котором можно проектировать общую архитектуру спроектированных схем, но комбинаторные методы используются для поиска в более широком диапазоне пространства параметров (с использованием вариантов каждого модуля в библиотеке). Сосредоточение внимания на комбинаторном отборе также может быть очень полезной стратегией на заре синтетической биологии, поскольку это может помочь нам быстрее изучить основные принципы проектирования.

Перспективы

Цель понимания того, как клетки общаются и принимают решения, остается очень привлекательной, особенно потому, что понимание молекулярного языка внутри клетки может позволить нам общаться с клетками и инструктировать их выполнять новые запрограммированные функции. Наша способность перепрограммировать клеточную передачу сигналов может обеспечить множество мощных приложений, таких как терапевтические клетки, запрограммированные на обнаружение селективного набора сигналов, связанных с заболеванием, и на локальный ответ точно адаптированным образом.

Хотя эволюция достигла такого рода инноваций и точной инженерии клеточных функций, мы только начинаем понимать, как достичь такой цели. У нас есть хорошее фундаментальное понимание логики клеточного сигнального механизма и источников функциональной пластичности. Кроме того, были сделаны важные первые шаги в разработке новых систем рецепторов/сенсоров, а также новых или модифицированных цепей обработки внутриклеточных сигналов. Несмотря на эти инструменты, на сегодняшний день было предпринято очень мало усилий, чтобы связать эти типы компонентов новыми способами, чтобы получить более крупные интегральные схемы, способные к высокоточным и точным откликам.Такие усилия предпринимаются. Например, Cell Propulsion Lab — это центр наномедицины Национального института здоровья (http://nihroadmap.nih.gov/nanomedicine/devcenters/cellularcontrol.asp), который пытается использовать относительно простые противоопухолевые иммунные клетки, сконструированные с помощью синтетических химерных антигенных рецепторов ( CAR), а также улучшают обработку их сигналов и набор ответов, которые они вызывают, чтобы оптимизировать клетки для размножения ex vivo , выживания in vivo , противоопухолевой цитотоксичности и разрушения благоприятного микроокружения опухоли. Будет интересно посмотреть, как будут разворачиваться такие усилия и как вызовы повысят сложность и надежность сотовой инженерии.

Инновационные датчики сигнализации

a | перенаправление собственных входных данных на новые выходные данные . С-концевой домен рецептора notch представляет собой фактор транскрипции, который высвобождается в результате трансмембранного протеолиза при активации лигандом дельта. Замена доменом альтернативного фактора транскрипции дает новый ответ экспрессии гена [26].Выход рецептора, связанного с G-белком (GPCR), можно перенаправить аналогичным образом путем слияния домена фактора транскрипции через связь с сайтом протеазы TEV. Активация GPCR приводит к рекрутированию белка аррестина. Если в клетке экспрессируется слитая протеаза аррестин-TEV, активация GPCR приводит к высвобождению транскрипционного фактора и выходу экспрессии нового гена [28]. Таким образом, активация GPCR может быть произвольно связана с новым выходом транскрипции. Выход рецепторной тирозинкиназы (RTK) может быть перенаправлен за счет привлечения синтетических адаптеров домена Sh3 или PTB к активированному и фосфорилированному по тирозину рецептору.Домен Sh3 можно использовать для рекрутирования протеазы TEV (для повторного высвобождения искусственно связанного транскрипционного домена) [28] или для рекрутирования новых эффекторных доменов, таких как те, которые участвуют в гибели клеток [29].

б | инженерный новый контроль ввода над собственными ответами . GPCR были сконструированы таким образом, чтобы их можно было контролировать низкомолекулярными агонистами путем мутации их внеклеточной поверхности таким образом, что они больше не связывают свои эндогенные лиганды (рецепторы, активируемые исключительно синтетическим лигандом — RASSL [32]).Рецепторы, которые активируют Т-клетки в ответ на произвольные входные данные, могут быть созданы путем слияния сконструированных одноцепочечных антител (scFv) с внутриклеточной областью Т-клеточного рецептора (дзета-цепь CD3) — так называемые химерные антигенные рецепторы (CAR) [16, 17]). Сигнальное событие, опосредованное рекрутированием, может быть поставлено под световой контроль путем замены эндогенного взаимодействия на светозависимую пару взаимодействий Phytochrome-PIF из растений [44].

Инженерно-пространственное регулирование

а | Схема поляризации дикого типа контролирует формирование одиночной почки. У почкующихся дрожжей локальная активация полярной ГТФазы Cdc42 усиливается петлей положительной обратной связи – активный Cdc42 рекрутирует каркасный белок Bem1, совместно собирает активированную киназу p21 (PAK – Ste20) и Cdc42 GEF (Cdc24). Хотя клетка может иметь несколько очагов Cdc42, они быстро превращаются в один доминантный очаг, который развивается только в почку клетки. Предполагается, что высокая скорость обмена диффундирующим комплексом Bem1/PAK/GEF между конкурирующими очагами Cdc42 имеет решающее значение для разделения на один доминантный очаг.

б | синтетический контур медленной поляризации приводит к формированию множественных почек . Чтобы проверить эту гипотезу, Bem1 был искусственно привязан к мембране через слитый мотив, нацеленный на мембрану [65]. Хотя этот привязанный к мембране Bem1 может правильно собирать комплекс Bem1/PAK/GEF в местах активности Cdc42 (т. е. в петле положительной обратной связи), обмен комплексом между конкурирующими фокусами Cdc42 происходит медленно (зависит от везикулярного транспорта через актиновые кабели и эндоцитоза). .Таким образом, эта синтетическая поляризационная схема приводит к плохому разрешению конкурирующих очагов Cdc42 и гораздо более высокой частоте (5% против ~ 0%) многопочковых клеток (микрофотографии из [65]).

Ссылки

2. Kiel C, Yus E, Serrano L. Инженерные пути передачи сигналов. Клетка. 2010;140(1):33–47. [PubMed] [Google Scholar]3. Спринзак Д, Эловиц МБ. Реконструкция генетических цепей. Природа. 2005; 438:443–8. [PubMed] [Google Scholar]4. Мукерджи С., ван Ауденарден А. Синтетическая биология: понимание биологического дизайна на основе синтетических схем. Нат Рев Жене. 2009; 10: 859–71. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]5. Башор С.Дж., Хорвиц А.А., Пейсайович С.Г., Лим В.А. Перепрограммирование клеток: синтетическая биология как инструмент для изучения принципов организации живых систем. Анну Рев Биофиз. 2010 16 февраля; [Epub перед печатью] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]6. Йе Б.Дж., Лим В.А. Синтетическая биология: уроки истории синтетической органической химии. Nat Chem Biol. 2007; 3: 521–5. [PubMed] [Google Scholar]7. Вайнберг Р. Биология рака.Гарланд Наука; 2006. [Google Scholar]9. Мюнтер С., Уэй М., Фришкнехт Ф. Передача сигналов при заражении патогенами. наук СТКЭ. 2006; 2006: re5. [PubMed] [Google Scholar] 10. Шан Л., Хе П., Шин Дж. Перехват сигнальных каскадов MAPK-хозяина бактериальными эффекторами типа III. Клеточный микроб-хозяин. 2007; 1: 167–74. [PubMed] [Google Scholar] 11. Кискинис Э., Эгган К. Прогресс в клиническом применении плюрипотентных стволовых клеток, специфичных для пациента. Джей Клин Инвест. 2010; 120:51–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]12.Линдвалл О., Кокая З. Стволовые клетки при нейродегенеративных заболеваниях человека — время для клинического применения? Джей Клин Инвест. 2010;120:29–40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]14. Варела-Роэна А., Карпенито С., Перес Э.Е., Ричардсон М., Парри Р.В., Милоне М., Шоллер Дж., Хао Х, Мексас А., Кэрролл Р.Г., Джун Ч.Х., Райли Дж.Л. Генная инженерия Т-клеток для адоптивной иммунотерапии. Иммунол Рез. 2008; 42:166–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]15. Ли С.К., Чоу Х., Хэм Т.С., Ли Т.С., Кислинг Д.Д. Метаболическая инженерия микроорганизмов для производства биотоплива: от жуков до синтетической биологии и топлива.Курр Опин Биотехнолог. 2008; 19: 556–63. [PubMed] [Google Scholar] 16. Садлен М., Брентдженс Р., Ривьер И. Перспективы и потенциальные ловушки химерных антигенных рецепторов. Курр Опин Иммунол. 2009; 21: 215–23. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]18. Тлсти ТД, Куссенс ЛМ. Строма опухоли и регуляция развития рака. Анну Рев Патол. 2006; 1:119–50. [PubMed] [Google Scholar] 19. Поусон Т., Нэш П. Сборка клеточных регуляторных систем через домены взаимодействия белков. Наука. 2003; 300:445–52.[PubMed] [Google Scholar] 20. Бхаттачарья Р.П., Ременьи А., Йех Б.Дж., Лим В.А. Домены, мотивы и каркасы: роль модульных взаимодействий в эволюции и проводке клеточных сигнальных цепей. Анну Рев Биохим. 2006; 75: 655–80. [PubMed] [Google Scholar] 23. Кэрролл СБ. Эво-дево и расширяющийся эволюционный синтез: генетическая теория морфологической эволюции. Клетка. 2008; 134:25–36. [PubMed] [Google Scholar] 24. Скотт Дж. Д., Поусон Т. Передача сигналов клетками в пространстве и времени: где белки собираются вместе и когда они расходятся.Наука. 2009;326:1220–4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]25. Пейсайович С., Гарбарино Дж., Вэй П., Лим В.А. Быстрая диверсификация фенотипов передачи сигналов клеток путем рекомбинации модульных доменов. Наука. в прессе. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]26. Струль Г., Адачи А. Ядерный доступ и действие выреза in vivo. Клетка. 1998; 93: 649–60. [PubMed] [Google Scholar] 27. Спринзак Д., Лаханпал А., Лебон Л., Сантат Л.А., Фонтес М.Е., Андерсон Г.А., Гарсия-Охалво Дж., Эловиц М.Б. Цис-взаимодействия между Notch и Delta генерируют взаимоисключающие состояния сигнализации.Природа. в прессе. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]28. Барни Г., Стрэппс В., Эррада Г., Берман Ю., Онг Дж., Клосс Б., Аксель Р., Ли К.Дж. Генетический дизайн сигнальных каскадов для регистрации активации рецепторов. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105: 64–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]29. Howard PL, Chia MC, Del Rizzo S, Liu FF, Pawson T. Перенаправление передачи сигналов тирозинкиназы на путь апоптотической каспазы через химерные адаптерные белки. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:11267–72.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30. Конклин Б.Р., Сяо Э.К., Клайсен С., Дюмуис А., Шринивасан С., Форсает Дж. Р., Геттье Дж. М., Чанг В. С., Пей И., Маккарти К. Д., Ниссенсон Р. А., Весс Дж., Бокерт Дж., Рот Б. Л. Разработка сигнальных путей GPCR с помощью RASSL. Нат Методы. 2008; 5: 673–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]31. Armbruster BN, Li X, Pausch MH, Herlitze S, Roth BL. Эволюция замка, чтобы он соответствовал ключу, для создания семейства рецепторов, связанных с G-белком, мощно активируемых инертным лигандом.Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104:5163–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]32. Кауард П., Вада Х.Г., Фальк М.С., Чан С.Д., Мэн Ф., Акил Х., Конклин Б.Р. Контроль передачи сигналов с помощью специально разработанного Gi-связанного рецептора. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95:352–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]33. Чжао Г.К., Чжан И., Хун М.А., Чандрашекар Дж., Эрленбах И., Рыба Н.Дж., Цукер К.С. Рецепторы сладкого вкуса и вкуса умами у млекопитающих. Клетка. 2003; 115: 255–66. [PubMed] [Google Scholar] 34. Редферн К.Х., Кауард П., Дегтярев М.Ю., Ли Э.К., Ква А. Т., Хеннигхаузен Л., Буджар Х., Фишман Г.И., Конклин Б.Р.Условная экспрессия и передача сигналов специально разработанного Gi-связанного рецептора у трансгенных мышей. Нац биотехнолог. 1999; 17: 165–9. [PubMed] [Google Scholar] 35. Корсон Т.В., Аберле Н., Крюс СМ. Дизайн и применение бифункциональных малых молекул: почему две головы лучше, чем одна. ACS Chem Biol. 2008; 3: 677–692. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]36. Поллок Р., Клаксон Т. Экспрессия генов, регулируемая димеризатором. Курр Опин Биотехнолог. 2002; 13: 459–67. [PubMed] [Google Scholar] 37. Ирвинг Б.А., Вайс А.Цитоплазматического домена дзета-цепи рецептора Т-клеток достаточно для соединения с путями передачи сигнала, связанными с рецептором. Клетка. 1991; 64: 891–901. [PubMed] [Google Scholar] 38. Гросс Г., Горохов Г., Вакс Т., Эшхар З. Создание эффекторных Т-клеток, экспрессирующих химерный Т-клеточный рецептор с типоспецифичностью антител. Пересадка Proc. 1989; 21: 127–30. [PubMed] [Google Scholar] 39. Эшхар З. , Вакс Т., Бендавид А., Шиндлер Д.Г. Функциональная экспрессия генов химерных рецепторов в Т-клетках человека. Дж Иммунол Методы.2001; 248: 67–76. [PubMed] [Google Scholar]40. Maher J, Brentjens RJ, Gunset G, Rivière I, Sadelain M. Цитотоксичность и пролиферация Т-лимфоцитов человека, управляемая одним химерным рецептором TCRzeta/CD28. Нац биотехнолог. 2002; 20:70–5. [PubMed] [Google Scholar]41. Карпенито С., Милоне М.С., Хассан Р., Симонет Д.К., Лахал М., Сухоски М.М., Варела-Роэна А., Хейнс К.М., Хейтян Д.Ф., Альбельда С.М., Кэрролл Р.Г., Райли Д.Л., Пастан И., Джун Ч. Контроль больших укоренившихся опухолевых ксенотрансплантатов с помощью генетически ретаргетированных Т-клеток человека, содержащих домены CD28 и CD137.Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:3360–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]42. Чжан Ф., Араванис А.М., Адамантидис А., де Лесеа Л., Дейссерот К. Автоматические выключатели: оптические технологии для исследования нейронных сигналов и систем. Нат Рев Нейроски. 2007; 8: 577–81. [PubMed] [Google Scholar]43. Айран Р.Д., Томпсон К.Р., Фенно Л.Е., Бернштейн Х., Дейссерот К. Точный во времени контроль внутриклеточной передачи сигналов in vivo. Природа. 2009; 458:1025–9. [PubMed] [Google Scholar]44. Левская А., Вайнер О.Д., Лим В.А., Фойгт К.А.Пространственно-временной контроль клеточной передачи сигналов с помощью взаимодействия белков с переключаемым светом. Природа. 2009; 461:997–1001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]45. Ву Ю.И., Фрей Д., Лунгу О.И., Йериг А., Шлихтинг И., Кульман Б., Хан К.М. Генетически кодируемый фотоактивируемый Rac контролирует подвижность живых клеток. Природа. 2009; 461:104–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]46. Лим В.А. Модульная логика сигнальных белков: построение аллостерических переключателей из простых связывающих доменов. Curr Opin Struct Biol.2002; 12: 61–8. [PubMed] [Google Scholar]47. Прехода К.Е., Скотт Дж.А., Маллинз Р.Д., Лим В.А. Интеграция нескольких сигналов посредством совместной регуляции комплекса N-WASP-Arp2/3. Наука. 2000; 290:801–6. [PubMed] [Google Scholar]48. Ю. Б., Мартинс И. Р., Ли П., Амарасинге Г. К., Уметани Дж., Фернандес-Запико М. Е., Билладо Д. Д., Мачиус М., Томчик Д. Р., Розен М. К.. Структурно-энергетические механизмы кооперативного аутоингибирования и активации Vav1. Клетка. 2010; 140: 246–56. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]49.Дюбер Дж. Э., Йе Б. Дж., Чак К., Лим В. А. Перепрограммирование управления аллостерическим сигнальным переключателем посредством модульной рекомбинации. Наука. 2003; 301:1904–8. [PubMed] [Google Scholar]50. Йе Б.Дж., Рутильяно Р.Дж., Деб А., Бар-Саги Д., Лим В.А. Изменение путей клеточной морфологии с помощью синтетических факторов обмена гуаниновых нуклеотидов. Природа. 2007; 447: 596–600. [PubMed] [Google Scholar]51. Дюбер Дж. Э., Мирский Э. А., Лим В. А. Разработка синтетических сигнальных белков со сверхчувствительным контролем ввода/вывода. Нац биотехнолог.2007; 25:660–2. [PubMed] [Google Scholar]52. Ядав С.С., Йе Б.Дж., Крэддок Б. П., Лим В.А., Миллер В.Т. Реинжиниринг сигнальных свойств киназ семейства Src. Биохимия. 2009; 48:10956–62. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]53. Гаррингтон Т.П., Джонсон Г.Л. Организация и регуляция сигнальных путей митоген-активируемых протеинкиназ. Curr Opin Cell Biol. 1999; 11: 211–8. [PubMed] [Google Scholar]54. Шварц М.А., Мадхани HD. Принципы специфичности передачи сигналов киназы MAP у Saccharomyces cerevisiae.Анну Рев Жене. 2004; 38: 725–48. [PubMed] [Google Scholar]55. Чой К.Ю., Саттерберг Б., Лайонс Д.М., Элион Э.А. Ste5 связывает множественные протеинкиназы в каскаде киназ MAP, необходимом для спаривания у S. cerevisiae. Клетка. 1994;78(3):499–512. [PubMed] [Google Scholar]56. Printen JA, Sprague GF., Jr Белок-белковые взаимодействия в пути реакции дрожжевого феромона: Ste5p взаимодействует со всеми членами каскада киназ MAP. Генетика. 1994;138(3):609–19. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]57. Посас Ф., Сайто Х.Осмотическая активация пути HOG MAPK через Ste11p MAPKKK: роль каркаса Pbs2p MAPKK. Наука. 1997; 276 (5319): 1702–1705. [PubMed] [Google Scholar]58. Парк С.Х., Зарринпар А., Лим В.А. Изменение путей киназы MAP с использованием альтернативных механизмов сборки каркаса. Наука. 2003; 299:1061–4. [PubMed] [Google Scholar]59. Харрис К., Ламсон Р.Е., Нельсон Б., Хьюз Т.Р., Мартон М.Дж., Робертс С.Дж., Бун С., Прицяк П.М. Роль каркасов в специфичности пути киназы MAP выявляется с помощью индивидуального дизайна сигнальных белков, предназначенных для пути.Карр Биол. 2001; 11 (23): 1815–24. [PubMed] [Google Scholar] 60. Dodge-Kafka KL, Soughayer J, Pare GC, Carlisle Michel JJ, Langeberg LK, Kapiloff MS, Scott JD. Заякоривающий белок протеинкиназы А mAKAP координирует два интегрированных эффекторных пути цАМФ. Природа. 2005; 437 (7058): 574–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]61. Мишра П., Соколич М., Уолл М.А., Грейвс Дж., Ван З., Ранганатан Р. Динамические леса в сигнальной системе, связанной с G-белком. Клетка. 2007;131(1):80–92. [PubMed] [Google Scholar]62.Башор С. Дж., Хелман Н.К., Ян С., Лим В.А. Использование сконструированных каркасных взаимодействий для изменения динамики передачи сигналов киназного пути MAP. Наука. 2008;319(5869):1539–43. [PubMed] [Google Scholar]63. Чант Дж. Полярность клеток у дрожжей. Annu Rev Cell Dev Biol. 1999; 15: 365–91. [PubMed] [Google Scholar]64. Козубовски Л., Сайто К., Джонсон Дж.М., Хауэлл А.С., Зила Т.Р., Лью Д.Дж. Поляризация с нарушением симметрии, управляемая комплексом Cdc42p GEF-PAK. Карр Биол. 2008;18(22):1719–26. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]65. Хауэлл А.С., Сэвидж Н.С., Джонсон С.А., Боуз И., Вагнер А.В., Зила Т.Р., Нейхаут Х.Ф., Рид М.С., Горячев А.Б., Лью Д.Дж.Сингулярность в поляризации: перепрограммирование дрожжевых клеток для образования двух почек. Клетка. 2009;139(4):731–43. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]66. Зарринпар А, Парк С.Х., Лим В.А. Оптимизация специфичности в сети взаимодействия клеточных белков с помощью отрицательного отбора. Природа. 2003; 426 (6967): 676–80. [PubMed] [Google Scholar]67. Stiffler MA, Chen JR, Grantcharova VP, Lei Y, Fuchs D, Allen JE, Zaslavskaia LA, MacBeath G. Селективность связывания домена PDZ оптимизирована для протеома мыши. Наука. 2007;317(5836):364–9.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]68. Эрнст А., Сазински С.Л., Хуэй С., Каррелл Б., Дарси М., Сешагири С., Бадер Г.Д., Сидху С.С. Быстрая эволюция функциональной сложности в семействе доменов. Научный сигнал. 2009;2(87):ra50. [PubMed] [Google Scholar]69. Григорян Г., Рейнке А.В., Китинг А.Е. Дизайн специфичности взаимодействия с белками дает селективные bZIP-связывающие пептиды. Природа. 2009;458(7240):859–64. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]70. Хуанг Дж., Койде А., Макабе К., Койде С. Дизайн белковых функций резко меняется благодаря направленной эволюции интерфейса домена.Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(18):6578–83. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]71. Зауэр Б. Нацеливание на индуцируемые гены у мышей с использованием системы Cre/lox. Методы. 1998;14(4):381–92. [PubMed] [Google Scholar]

Произошла ошибка при настройке файла cookie пользователя

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Настройка клеточной сигнализации с использованием спроектированных генетических логических цепей время удвоения может быть всего 1.9ч. Однако ограниченные генетические инструменты в настоящее время ограничивают его дальнейшие исследования и усилия по применению с использованием подходов синтетической биологии. В этом исследовании был систематически разработан и оптимизирован ряд генетических инструментов для

Synechococcus 2973. Во-первых, введение гена pilN сборки ворсинок Tfp в Synechococcus 2973 успешно восстановило его естественную трансформируемость, что значительно упростило ДНК. процесс трансформации. Во-вторых, была оценена серия промоторов с различной силой, и сверхсильные промоторы, включая P cpc560 из Synechocystis sp.PCC 6803, нативный P psbA2 и P psbA3 из Synechococcus 2973 были обнаружены с самой высокой активностью β -галактозидазы среди тех, которые оценивались по значениям Миллера. Некоторые промоторы, связанные с фотосигналами (I.E., P PSBA2 , P PSBA3 , P 6803PSBA2 и P CPC560 ) также были продемонстрированы высокой интенсивностью света. В-третьих, были оценены три системы индукции лактозы, среди которых P lac в сочетании с lacI q показали наилучшие перспективы применения с большой индукционной способностью, низкой утечкой и средней индуцированной экспрессией.В-четвертых, трансляционный рибопереключатель theoE* , транскрипционный рибопереключатель theo/yitJ и xpt(C74U)/metE , а также искусственная индуцирующая система, сочетающая theoE* с РНК-полимеразой Т7, были успешно разработаны и охарактеризованы в году. Synechococcus 2973. Наконец, с помощью системы индукции T7 для контроля экспрессии как малой РНК, так и шаперона Hfq, был разработан и оптимизирован регуляторный инструмент малой РНК, который является строго индуцируемой выключенной системой для регуляции генов в Synechococcus 2973.Работа здесь представила ценные наборы генетических инструментов, необходимых для метаболической инженерии и исследований в области синтетической биологии в Synechococcus 2973, что облегчит будущее применение быстрорастущего шасси цианобактерий.

%PDF-1.7 % 799 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 799 119 0000000016 00000 н 0000003580 00000 н 0000003811 00000 н 0000003838 00000 н 0000003892 00000 н 0000004021 00000 н 0000004057 00000 н 0000004475 00000 н 0000004593 00000 н 0000004711 00000 н 0000004864 00000 н 0000004982 00000 н 0000005101 00000 н 0000005220 00000 н 0000005337 00000 н 0000005453 00000 н 0000005571 00000 н 0000005690 00000 н 0000005809 00000 н 0000005925 00000 н 0000006043 00000 н 0000006162 00000 н 0000006279 00000 н 0000006396 00000 н 0000006555 00000 н 0000006751 00000 н 0000006831 00000 н 0000006911 00000 н 0000006991 00000 н 0000007072 00000 н 0000007152 00000 н 0000007232 00000 н 0000007312 00000 н 0000007391 00000 н 0000007470 00000 н 0000007550 00000 н 0000007629 00000 н 0000007708 00000 н 0000007788 00000 н 0000007867 00000 н 0000007946 00000 н 0000008025 00000 н 0000008105 00000 н 0000008184 00000 н 0000008263 00000 н 0000008342 00000 н 0000008420 00000 н 0000008498 00000 н 0000008576 00000 н 0000008653 00000 н 0000008732 00000 н 0000008812 00000 н 0000008892 00000 н 0000008972 00000 н 0000009052 00000 н 0000009314 00000 н 0000009558 00000 н 0000009830 00000 н 0000010532 00000 н 0000010938 00000 н 0000011110 00000 н 0000011288 00000 н 0000011700 00000 н 0000011994 00000 н 0000012097 00000 н 0000012586 00000 н 0000012896 00000 н 0000013219 00000 н 0000013288 00000 н 0000013651 00000 н 0000013853 00000 н 0000016254 00000 н 0000016438 00000 н 0000016687 00000 н 0000019003 00000 н 0000019537 00000 н 0000019929 00000 н 0000022349 00000 н 0000024279 00000 н 0000026328 00000 н 0000028407 00000 н 0000030529 00000 н 0000032601 00000 н 0000039609 00000 н 0000043543 00000 н 0000046440 00000 н 0000046840 00000 н 0000051162 00000 н 0000051942 00000 н 0000052141 00000 н 0000053449 00000 н 0000053679 00000 н 0000053738 00000 н 0000054063 00000 н 0000054257 00000 н 0000054541 00000 н 0000055076 00000 н 0000055196 00000 н 0000073472 00000 н 0000073511 00000 н 0000074058 00000 н 0000074195 00000 н 0000099327 00000 н 0000099366 00000 н 0000099921 00000 н 0000100067 00000 н 0000150238 00000 н 0000150277 00000 н 0000150335 00000 н 0000150546 00000 н 0000150741 00000 н 0000150846 00000 н 0000150986 00000 н 0000151108 00000 н 0000151284 00000 н 0000151508 00000 н 0000151764 00000 н 0000152044 00000 н 0000002676 00000 н трейлер ]/предыдущая 3788358>> startxref 0 %%EOF 917 0 объект >поток hb«c`f«x €

Донести сообщение, STAT! Принципы построения молекулярной сигнальной цепи | Журнал клеточной биологии

Транскрипционные факторы STAT, обычно называемые «латентными цитоплазматическими белками», претерпели фундаментальную переоценку своих динамических свойств. Этот обзор фокусируется на недавних исследованиях, которые идентифицировали непрерывный независимый от транспортного фактора ядерно-цитоплазматический цикл STAT1, STAT3 и STAT5 в качестве основного принципа передачи сигналов цитокинов. Кроме того, были обнаружены молекулярные механизмы, которые модулируют скорость потока или вызывают задержку, и вместе эти открытия обеспечили новое понимание правил обработки клеточных сигналов.

Пути янус-киназы (JAK)/преобразователя сигналов и активатора транскрипции (STAT), впервые идентифицированные в интерфероновых системах, реагируют на широкий спектр цитокинов и факторов роста (Levy and Darnell, 2002).Белки STAT получают сигналы цитокинов через внутриклеточные рецепторные цепи в цитоплазме и переносят их в ядро, где они затем действуют как факторы транскрипции (Levy and Darnell, 2002). Таким образом, эти белки должны пересекать ядерную оболочку, чтобы функционально связать клеточную мембрану с промоторами цитокин-чувствительных генов. Движение STAT в любом компартменте контролируется диффузией и не направлено вдоль постоянных структур (Lillemeier et al., 2001). Тем не менее, прохождение через ядерные шлюзы, называемые комплексами ядерных пор (NPC), обеспечивает мощный диффузионный барьер для белков размером со STAT (> 85 кДа для мономера; рис.1), так как только ионы и малые молекулы, не превышающие 40 кДа, могут свободно проникать в ядро ​​клетки (Suntharalingam, Wente, 2003). Анализ их ядерно-цитоплазматической транслокации должен учитывать, что белки STAT существуют в двух различных состояниях с точки зрения передачи сигналов: до стимуляции клеток цитокинами молекула STAT существует в нетирозин-фосфорилированном состоянии, статус олигомеризации которого все еще обсуждается (Sehgal , 2000). Стимуляция цитокинами увеличивает активность связанных с рецептором киназ JAK и приводит к образованию тирозин-фосфорилированных STAT, которые мгновенно собираются в гомо- или гетеродимеры посредством канонических взаимодействий фосфотирозин-Sh3-домен (Shuai et al. , 1994; Гринлунд и др., 1995). Фосфорилирование тирозина часто описывают как активацию STAT, поскольку только димер представляет собой высокоаффинный ДНК-связывающий белок, необходимый для индукции цитокин-чувствительных генов (Shuai et al., 1994). Это достигается прямым нацеливанием на родственные элементы распознавания, называемые гамма-активированными сайтами (GAS) (Horvath et al., 1995).

Известно, что для прохождения белков через ядерную пору существуют как носитель-зависимый, так и независимый от носителя способы транслокации (Komeili and O’Shea, 2001).NPC представляет собой мультибелковую структуру, которая создает водный канал, охватывающий двойную мембрану ядерной оболочки (Suntharalingam and Wente, 2003). Эта структура с предполагаемой молекулярной массой 125 МДа в клетках млекопитающих состоит из нескольких копий примерно 30 различных белков, которые в совокупности называются нуклеопоринами (Nups), многие из которых содержат множественные фенилаланин-глициновые (FG) повторы, перемежающиеся полярными остатками различных типов. номер (Suntharalingam and Wente, 2003). Ключевые положения моделей транслокации NPC основаны на том, что транслоцирующие молекулы обладают слабой аффинностью связывания с рядом нуклеопоринов (Suntharalingam and Wente, 2003).Биохимически безносительская и зависимая от носителя ядерно-цитоплазматическая транслокация родственны. Стыковка с NPC контролируется диффузией для двух путей, и в обоих случаях фактический процесс транслокации, по-видимому, происходит независимо от метаболической энергии посредством идентичных взаимодействий с компонентами канала (Kose et al., 1997; Schwoebel et al., 1998). Белки, которые содержат области, которые позволяют им напрямую участвовать в продуктивных взаимодействиях с нуклеопоринами, способны к независимому от переносчика ядерно-цитоплазматическому транспорту, тогда как остальные белки (также называемые грузовыми белками) должны ассоциироваться с транспортными факторами, которые действуют как шапероны во время прохождения через мембрану. НПС.Подавляющее большинство транспортных факторов относится к суперсемейству кариофериновых белков, которые опосредуют либо импорт, либо экспорт из ядра (Wozniak et al. , 1998). Распознавание грузовых белков транспортными факторами требует присутствия свободно консервативных участков аминокислот на поверхности груза, называемых сигналами ядерной локализации (NLS) или сигналами ядерного экспорта (NES) соответственно (Wozniak et al., 1998). Стабильность комплексов груз/кариоферин определяется малой GTPase Ran, поскольку RanGTP разрушает комплексы импортин/карго, но стабилизирует образование комплексов экспортин/карго (Komeili and O’Shea, 2001).Т.о., градиент RanGDP/RanGTP, который формируется за счет асимметричного распределения факторов обмена нуклеотидов по ядерной оболочке, отличает цитозоль от нуклеоплазмы и, следовательно, придает направленность транспортному процессу (Komeili and O’Shea, 2001). Далее автор описывает, как STAT используют оба этих механизма транслокации.

Признание того, что цитоплазматические и ядерные пулы белков STAT быстро и количественно обмениваются еще до их активации, резко контрастирует с общепринятыми учебниками, где нефосфорилированные STAT обычно описываются как исключительно цитоплазматические белки. Тем не менее, стало ясно, что только нефосфорилированная молекула STAT наделена способностью как импорта, так и экспорта из ядра (Fig. 2A, синие стрелки; Marg et al., 2004). Хотя сообщалось о нефосфорилированных STAT в клеточном ядре до стимуляции (Chatterjee-Kishore et al., 2000; Meyer et al., 2002b), высокодинамичное поведение STAT в покоящихся клетках было обнаружено только недавно. Внутриклеточную преципитацию STAT1 после микроинъекции специфических антител в сочетании с микроинъекцией рекомбинантных STAT использовали для оценки скорости потока в живых клетках.Эти эксперименты были дополнены анализом пермеабилизированных клеток, и вместе эти подходы привели к открытию того, что нефосфорилированные STAT1, STAT3 и STAT5 постоянно перемещаются между цитозолем и ядром с помощью механизма, который не требует метаболической энергии или транспортных факторов (Meyer et al. , 2002a; Марг и др., 2004).

Поскольку также было показано, что STAT1 связывается с нуклеопоринами, STAT могут быть добавлены к все еще короткому, но растущему списку регуляторов транскрипции, которые непосредственно взаимодействуют с NPC (Marg et al. , 2004; Сюй и Массаге, 2004 г.). Транслокация STATs без переносчиков является насыщаемой и, по-видимому, влечет за собой взаимодействия с белками пор, которые являются общими для белков STAT, и с importin-β (Marg et al., 2004). Несмотря на это, общий структурный знаменатель для связывания с комплексом ядерной поры не просматривается (Xu and Massagué, 2004). Алкилирование in vitro N-этилмалеимидом одного цистеина предотвращает ядерно-цитоплазматическую транслокацию STAT1. Модифицированный остаток расположен в гидрофобной бороздке на поверхности α-спирального линкерного домена.Следовательно, мы условно обозначаем функционально плохо охарактеризованный линкерный домен как домен связывания NPC. Однако могут участвовать и другие области молекулы STAT (Marg et al., 2004).

Несмотря на их постоянный ядерно-цитоплазматический цикл, изображения иммунофлуоресцентной микроскопии показывают преимущественно цитоплазматическую локализацию большинства STAT в покоящихся клетках. Для других преобразователей сигнала челнока отклонение от панцеллюлярного распределения было связано с их связыванием с факторами закрепления (Xu and Massagué, 2004).Для STAT, по-видимому, действует альтернативный механизм. В дополнение к транспорту без переносчиков переносимые богатые лейцином экспортные сигналы были идентифицированы в различном количестве и в разных местах в STAT1, STAT3, STAT5 млекопитающих (Begitt et al., 2000; Bhattacharya and Schindler, 2003; McBride et al., 2000; Zeng et al., 2002), слизевики STATa и STATc (Ginger et al., 2000; Fukuzawa et al., 2003). Такие сигналы, которые составляют прототип поверхности связывания экспортного рецептора CRM1 (Komeili and O’Shea, 2001), первоначально считалось, что функционируют только во время прекращения индуцированного цитокинами накопления в ядре, но теперь было продемонстрировано, что CRM1- зависимый экспорт работает конститутивно (Andrews et al., 2002; Цзэн и др., 2002; Марг и др., 2004). Более того, инактивация Ran-зависимого транспорта или специфическая инактивация CRM1 превращают преимущественно цитоплазматическую локализацию STAT1 в панцеллюлярное распределение (Marg et al. , 2004). Это указывает на то, что носитель-независимый и носитель-зависимый транспорт совместно определяют внутриклеточное распределение. Тем не менее, блокирование CRM1 низкомолекулярными ингибиторами не привело к заметному снижению скорости переноса эндогенного STAT1, как было определено с помощью микроинъекции антител, что указывает на то, что переносчик-зависимый транспорт играет лишь незначительную роль в общей скорости переноса (рис.2 А, желтая стрелка; Марг и др., 2004). Остается открытым вопрос, обусловлены ли типоспецифические и STAT-специфические различия в распределении модуляциями реальных событий транслокации, или же требуются дополнительные механизмы, такие как ретенция. Интересно, что ядерный экспорт Dictyostelium STATa, который содержит консенсусные сайты связывания CRM-1, усиливался после фосфорилирования серина, опосредованного гликогенсинтазкиназой-3 (Ginger et al., 2000), что продемонстрировало роль посттрансляционного изменения в транспортной модуляции.На данный момент о конститутивно действующих сигналах ядерного импорта, которые опосредуют зависимый от переносчика ядерный импорт, не сообщалось для белка STAT, но STAT содержат условные NLS, которые действуют во время цитокиновой стимуляции клеток.

Цитокиновая стимуляция клеток повышает активность ассоциированных с рецептором киназ JAK, что приводит к фосфорилированию тирозина и димеризации STAT — двум условиям сопутствующей ядерной транслокации транскрипционно-активных STAT, которые были известны с самого начала (Schindler et al., 1992; Шуай и др., 1994). Флуоресцентная микроскопия стимулированных живых или фиксированных клеток выявила характерное накопление ядер, связанное с тирозиновым фосфорилированием STAT (Schindler et al., 1992). В зависимости от типа клеток и интенсивности стимула накопление ядер заметно уже через 10 минут после добавления цитокинов и может продолжаться в течение нескольких часов, прежде чем STAT постепенно вернутся к своему распределению в состоянии покоя. Однако обработка цитокинами индуцирует фосфорилирование не более ~30% молекул STAT1 в фибробластах Bud-8 или клетках карциномы шейки матки HeLa (Haspel et al. , 1996; неопубликованные данные). Функциональные данные показывают, что это количество также представляет активные димеры. Это было установлено на основании совместной экспрессии STAT1 дикого типа и мутанта с дефектным фосфорилированием тирозина (Tyr701Phe). Хотя стимуляция интерфероном индуцировала накопление в ядре молекул дикого типа, транслокация мутанта не была различима (неопубликованные данные). Однако в случае гетеродимеров STAT1/STAT2 однократно тирозин-фосфорилированные димеры были обнаружены in vitro, но вопрос о том, участвовали ли эти молекулы в индуцированном цитокинами импорте в ядро, не был решен (Gupta et al., 1996). Таким образом, в клетках, стимулированных цитокинами, в любой данный момент времени значительная часть молекул STAT продолжает свое перемещение без переносчиков без изменений (рис. 2В, синие стрелки). Это объясняет, почему эксперименты по субклеточному фракционированию не могли подтвердить очевидную количественную ядерную транслокацию STAT, наблюдаемую с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (Haspel et al. , 1996; Meyer et al., 2002a).

Отсутствие легко различимых сайтов связывания импортина в молекуле STAT вызвало поиск запускаемых цитокинами событий, отличных от фосфорилирования тирозина, которые участвуют в ядерном импорте димерных STAT, таких как комплексообразование с лигандами или образование эндоцитозных везикул (Johnson и другие., 1998). Эти события могут происходить, но димеры STAT1 не требуют стимуляции цитокинами для их ядерной транслокации и накопления. Это было ясно продемонстрировано микроинъекцией рекомбинантного фосфорилированного STAT1 (Meyer et al., 2003).

Автономный ядерный импорт STAT1 без переносчиков нейтрализуется димеризацией (Marg et al., 2004; Fig. 2B, желтые стрелки), тогда как стандартная модель функционирования STAT утверждает, что димеризация индуцирует ядерный импорт.Таким образом, STAT-димеры отличаются вовсе не способностью к ядерному импорту, а переключением на носитель-зависимую транслокацию. Задолго до открытия STAT NLS из экспериментов по преципитации STAT1 был сделан вывод, что димеризация способствует ассоциации со специфическими транспортными факторами импортина (Sekimoto et al., 1997). Подобно другим NLS-содержащим белкам, димерный STAT1 транспортируется в ядро ​​Ran-зависимым образом с помощью комплекса, содержащего импортин-β и импортин-α, стехиометрия которого неизвестна (Sekimoto et al., 1996, 1997; Фагерлунд и др., 2002). Среди шести различных белков импортина-α человека только импортин-α5 (hSRP1, NPI-1), по-видимому, распознает гомодимер STAT1 и гетеродимер STAT1/STAT2 (Sekimoto et al., 1997; Fagerlund et al., 2002). Ассоциация с кариоферинами до сих пор не изучена для других белков STAT. Примечательно, что область importin-α5, необходимая для связывания обычных NLS, отличается от области, необходимой для связывания STAT (Sekimoto et al., 1997; Melén et al., 2003).

В недавнем прошлом консервативный NLS был идентифицирован в ДНК-связывающем домене STAT1, STAT2 и STAT3 (Melén et al. , 2001; McBride et al., 2002; Meyer et al., 2002a; Ma et al. ., 2003). Для STAT1 это было довольно случайным открытием, т.к. выделенные пептиды, содержащие NLS, придают гетерологичному белку активность ядерного экспорта, но не ядерного импорта (McBride et al., 2000; Meyer et al., 2002a).Т.о., этот непередаваемый сигнал необычной аминокислотной последовательности является функциональным и необходимым только в димере STAT и поэтому был назван димер-специфическим NLS (dsNLS; Meyer et al., 2002a). Тем не менее, мутации этого сигнала в одном мономере оказывается достаточно, чтобы предотвратить ассоциацию димера с импортином-α и, следовательно, мешать транскрипции генов, индуцированной цитокинами (Fagerlund et al., 2002; Meyer et al., 2002a), тогда как вклад этот сигнал к ядерному экспорту STAT1 не был однозначно продемонстрирован (McBride et al., 2000). dsNLS недостаточно для ядерного импорта димеров STAT. Удаление аминотерминального домена или мутации в спирально-спиральном домене исключают импорт в ядро ​​после стимуляции цитокинами (Strehlow and Schindler, 1998; Ma et al. , 2003).

Стало очевидным, что переход на носитель-зависимый ядерный импорт не является причиной накопления STAT в ядре, поскольку носитель-зависимый и носитель-независимый ядерный импорт, по-видимому, происходит с одинаковой или одинаковой скоростью (Meyer et al., 2003; Марг и др., 2004). Следовательно, решающим событием, связанным с тирозиновым фосфорилированием STAT, является индукция конформации STAT, способной сохраняться в ядре. Этот вывод основан на двух наблюдениях, сделанных для STAT1 (Meyer et al., 2003). Во-первых, ингибирование тирозинфосфатаз препятствует ядерному экспорту как эндогенного, так и микроинъецированного рекомбинантного фосфорилированного белка. Во-вторых, создание ДНК-связывающих мутантов STAT1 показало, что продолжительность накопления ядер коррелирует с авидностью связывания ДНК.Из этого далее было выведено, а затем продемонстрировано, что дефосфорилирование блокируется, когда STAT1 связывается с ДНК (Meyer et al. , 2003). Эти находки дополняют более ранние исследования, которые продемонстрировали роль ядерных фосфатаз и дефосфорилирования тирозина в накоплении STAT в ядре (Shuai and Liu, 2003).

Итак, какую роль играет связывание ДНК в удержании STAT в ядре? Интуитивно привлекательная модель ядерного накопления STAT1 утверждала, что NES маскируется связыванием ДНК (McBride et al., 2000). Согласно этой модели, которая не делает явного различия между фосфорилированными и нефосфорилированными STAT с точки зрения экспорта, потеря связывания ДНК неизбежно связана с потерей удержания в ядре. Однако это предположение было опровергнуто экспериментальными данными, поскольку мутант STAT1 без какой-либо способности связываться с ДНК мог, тем не менее, нормально накапливаться, если предотвратить расщепление димера в результате дефосфорилирования (Meyer et al., 2003, 2004). Как следствие этих системных характеристик, ядерный экспорт и реакции связывания ДНК не конкурируют за STAT. Хотя в принципе связывание ДНК не требуется для удержания STATs в ядре, оно, тем не менее, обеспечивает защиту от чрезвычайно высокой активности дефосфорилирования в ядре. Ключевым параметром, который следует учитывать, является скорость диссоциации STAT/ДНК, которая может значительно различаться между различными сайтами связывания STAT (Vinkemeier et al., 1996). Было обнаружено, что скорость дефосфорилирования тирозина прямо пропорциональна скорости диссоциации ДНК (Meyer et al., 2003). Эти эксперименты выявили критическую роль неспецифического связывания ДНК в удержании в ядре STAT1 дикого типа.Следовательно, исследования кинетики неспецифического связывания ДНК также необходимы для лучшего понимания того, как STAT локализуют свои сайты-мишени на хроматине (von Hippel, 2004).

Важно отметить, что эта установка предсказывает, что активность фактора транскрипции распространяется на сайты с низкой скоростью диссоциации ДНК, другими словами, на GAS-содержащие промоторы-мишени. Это ожидание было подтверждено in vivo для связывания STAT3 с природным промотором (Lerner et al., 2003). Тем не менее, быстрое дефосфорилирование приводит к тесной связи активности рецептора с транскрипционной активностью в ядре. Для STAT3 было обнаружено, что время полужизни димера составляет всего 15 минут даже на целевом промоторе (Lerner et al., 2003). Соответственно, быстрое перемещение происходит также во время накопления ядра (Meyer et al., 2003), когда эффективные скорости экспорта особенно важны для обеспечения последовательных циклов рефосфорилирования с целью поддержания постоянного уровня транскрипционно-активных молекул в ядре (Andrews et al. ., 2002; Мейер и др., 2003; Swameye и др., 2003).

Недавнее исследование динамического перераспределения факторов транскрипции STAT подтвердило, что их название, придуманное в лаборатории Дарнелла, было выбрано правильно. Уже перед стимуляцией цитокинами эти белки участвуют в быстром ядерно-цитоплазматическом циклировании посредством простого, независимого от кариоферина механизма. Параллельный ядерный экспорт посредством классического экспортин-зависимого пути был определен для STAT1 для достижения преимущественно цитоплазматического стационарного распределения, которое характерно для многих различных клеток.При воздействии цитокинов значительная часть STAT фосфорилируется по тирозину и димеризуется посредством взаимодействий доменов Sh3. Это изменение в структуре имеет важные функциональные последствия. Это позволяет осуществлять высокоаффинное связывание ДНК, и в то же время выявляется нетрадиционный, но тем не менее кариоферин-зависимый сигнал ядерной локализации. Макроскопически эти события проявляются как временное накопление ядер, которое, однако, не является результатом переключения на носитель-зависимый импорт.Скорее, димеризация предотвращает не только дальнейший ядерно-цитоплазматический цикл STAT без переносчиков, но и их ядерный экспорт в целом. Хотя внутриядерная подвижность STAT-димеров остается на диффузионном пределе (Meyer et al., 2003, 2004), они, тем не менее, захвачены в этом компартменте до их дефосфорилирования тирозина. Важно отметить, что было определено, что скорость дефосфорилирования прямо пропорциональна скорости диссоциации ДНК, что указывает на неспецифическое связывание ДНК в ядерно-цитоплазматическом цикле STAT.Соответственно, на промоторах-мишенях лучше всего сохраняется транскрипционно активный фактор. Несмотря на это, реакция дефосфорилирования протекает с периодами полураспада менее 15–30 мин, что делает ядерное накопление динамическим процессом, который поддерживается непрерывным челночным движением и активностью киназы.

Будущие исследования должны быть сосредоточены на молекулярных механизмах, которые приводят к модуляции потока, либо физиологически, либо в патологических ситуациях, таких как микробные инфекции.Это имеет решающее значение для определения функциональных последствий ядерно-цитоплазматического цикла для передачи сигналов цитокинов и не только.

Оценка влияния мутаций, обнаруженных в данных секвенирования следующего поколения, на сигнальные пути человека | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Современные технологии секвенирования дают все более подробные данные о геномной изменчивости. Однако традиционные методы сопоставления отдельных вариантов или мутировавших генов с фенотипами имеют известные ограничения, учитывая сложную, мультигенную природу многих заболеваний или признаков.Здесь мы представляем PATHiVar, веб-инструмент, который объединяет данные о геномных вариациях с информацией о тканях экспрессии генов. PATHiVar представляет собой новое поколение методов анализа геномных данных, которые позволяют изучать варианты, обнаруженные в эксперименте по секвенированию следующего поколения, в контексте сигнальных путей. Простые булевы модели путей обеспечивают подробное описание влияния мутаций на функциональность клеток, поэтому рецидивы функциональных сбоев можно легко связать с заболеваниями, даже если они вызваны мутациями в разных генах.Паттерны изменений в цепях передачи сигнала, часто непредсказуемые из-за мутации отдельных генов, соответствуют паттернам затронутых функций, которые могут быть связаны со сложными признаками, такими как прогрессирование заболевания, ответ на лекарство и т. д. PATHiVar доступен по адресу: http://pathivar.babelomics .орг.

ВВЕДЕНИЕ

Полное экзомное и геномное секвенирование становятся основными методологиями открытия новых генов болезней. В то время как найти гены болезни относительно легко в менделевских патологиях или de novo синдромах с высокой пенетрантностью, эта задача может стать чрезвычайно сложной в случае распространенных заболеваний (1).Из-за их мультигенной природы большинство сложных заболеваний лучше понимать как отказы функциональных модулей, вызванные различными комбинациями мутировавших генов, а не уникальными мутациями в одном отдельном гене. Эта идея о модульной природе генетических заболеваний человека (2), которая объясняет такие явления, как эпистаз (3), неполная пенетрантность, невоспроизводимость биомаркеров (4) и т. д., может быть полезна для поиска генов болезней (5), лекарств. мишени (6), биомаркеры на основе механизма нового поколения (7) и т. д.в контексте известных функциональных модулей. В частности, сигнальные пути являются функциональными модулями, которые включают в себя представление доступных знаний о последствиях, которые комбинированный эффект активности белков оказывает на функциональность клетки в ответ на различные стимулы.

В последнее время некоторые методы, основанные на сигнальных путях, нацелены на обнаружение активации подсетей внутри них (8–10). Другие, более специфичные, сосредоточены на оценке активности сигнальных цепей стимул-ответ по данным экспрессии генов (11-13).Активность цепи передачи сигналов «стимул-реакция» может быть выведена из измерений экспрессии генов и обеспечивает богатый информативным типом биомаркеров, который можно в дальнейшем использовать для целей прогнозирования (7). Несмотря на очевидный потенциал путей как концептуальных инструментов для понимания влияния генных мутаций на клеточную передачу сигналов, отсутствие удобных приложений для этой цели резко ограничивает текущее применение этих методов.

Здесь мы представляем новый веб-сервер PATHiVAR, который можно использовать для простого определения мутаций, которые, как ожидается, будут иметь соответствующие последствия для функционирования клеток, поскольку они затрагивают гены, принадлежащие к сигнальным путям.Эти последствия могут быть дополнительно связаны со сложными фенотипами, такими как болезнь, реакция на лекарство и т. д. Поскольку разные ткани имеют разные модели экспрессии генов, прогнозируемые последствия будут специфичными для каждой ткани. PATHiVAR использует простую булевую модель для вывода вероятностей передачи сигнала в сигнальных путях человека от любого рецепторного белка к любому конечному эффекторному белку. Булева модель, используемая здесь, является упрощением, полученным из статистической модели, используемой в PATHiWAYS (12,13).В модели используются известные значения экспрессии генов, взятые из двух популярных репозиториев экспрессии генов (Human Protein Atlas (14) и Expression Atlas (15)), для получения индивидуальных вероятностей активации генов, которые комбинируются в соответствии с проводкой сигнальных цепей, чтобы сделать вывод, что мы рассматриваем невозмущенный характер передачи сигнала по всем выбранным путям в выбранной ткани. Затем входные файлы стандартного формата вызова вариантов (VCF), содержащие варианты, обнаруженные у людей, сканируются на наличие вариантов в генах, кодирующих белок, которые составляют пути.Вредоносность таких вариантов оценивается в соответствии с типами последствий вариантов, а также с пороговыми значениями, основанными на широко используемых индексах патогенности, которые могут быть настроены пользователем. Наконец, информация о функциональности белков интегрируется в модель путем удаления всех белков, поврежденных вредными мутациями. Модель пересчитана для возмущенной (мутировавшей) системы. Сравнение невозмущенной и возмущенной моделей дает важные сведения о влиянии вариантов на клеточную передачу сигналов.

PATHiVAR использовался в течение последнего года в контексте Испанской сети исследований редких заболеваний (CIBERER; http://www.ciberer.es) на последнем этапе определения приоритетов генов-кандидатов, созданных инструментом BiERapp. (16) (http://bierapp.babelomics.org).

PATHiVAR стремится дать ключ к пониманию того, как взаимодействия между белками, составляющими сигнальные пути, объясняют функциональные возможности клеток и как нарушения таких функциональных возможностей связаны со сложными фенотипами, такими как заболевания.Насколько нам известно, другого подобного инструмента нет. PATHiVAR можно найти по адресу: http://pathivar.babelomics.org.

ОЦЕНКА ВРЕДНОСТИ МУТАЦИИ В КОНТЕКСТЕ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА

Моделирование сигналома человека

Булева модель используется для моделирования вероятностей передачи сигнала от рецептора к эффекторным белкам через 26 путей KEGG человека (17) из общих категорий «Обработка информации об окружающей среде» и «Клеточные процессы», которые включают соответствующие процессы и системы, такие как передача сигнала ( ERBB , WNT, NOTCH, JAK-STAT, кальций, VEGF, сигнальные пути HEDGEHOG и mTOR ), рост и гибель клеток ( апоптоз и сигнальный путь p53 ), клеточная связь ( GAP соединение и плотное соединение ), сигнальные молекулы и взаимодействие ( взаимодействие нейроактивного лиганда с рецептором, молекулы клеточной адгезии, взаимодействие цитокин-цитокиновый рецептор и взаимодействие EMC-рецептор ), эндокринная система ( сигнальный путь инсулина, сигнальный путь адипоцитокина, сигнальный путь PPAR, сигнальный путь GnRH и меланогенез ) и иммунная система ( toll-li сигнальный путь рецептора ke, сигнальный путь рецептора В-клетки, сигнальный путь рецептора Т-клетки, сигнальный путь Fc epsilon RI, процессинг и презентация антигена и сигнальный путь хемокина ).

Сигнальные цепи определяются как субпути (внутри путей), которые передают сигналы от рецепторного узла, получающего стимул, к эффекторному узлу, запускающему ответ. Такие цепи могут включать би- или мультифуркации и обычно состоят из узлов, которые активируют другие узлы, но они также могут содержать узлы, подавляющие активность других узлов. Узлы могут состоять из одного или нескольких белков. В булевой модели экспрессия гена принимается за показатель присутствия белка в пути (8,9,12,13,18).Вероятности 1 (присутствие) или 0 (отсутствие) присваиваются любому из белков в пути в соответствии с экспрессией гена, зарегистрированной для интересующей ткани в базе данных, выбранной для анализа. Всего доступно 48 тканей из базы данных Human Protein Atlas (14) и 66 тканей из Expression Atlas (15). Вероятности узлов вычисляются как: (i) произведение вероятностей составляющих их белков, если узел представляет собой белковый комплекс, или (ii) как максимум значений вероятностей белков, если они альтернативны (12,13). После того, как вероятности для каждого узла в цепи были назначены для конкретной ткани, можно использовать простое вероятностное произведение от рецепторного узла к эффекторному узлу через все соединительные узлы пути для моделирования вероятности передачи сигнала. 12,13). Мы называем невозмущенным сигнальным паттерном вероятности передачи сигнала, рассчитанные для всех цепей стимул-реакция по всем выбранным путям в конкретной анализируемой ткани.

Приведенные здесь модели охватывают широкий спектр тканей, собранных в базах данных Human Protein Atlas (14) и Expression Atlas (15). Однако некоторые гены могут иметь специфические значения экспрессии, которые не могут быть должным образом или точно представлены в базах данных или могут проявлять нетипичное поведение экспрессии в определенных условиях. Эти сценарии можно смоделировать с помощью поля Дополнительный список генов , которое позволяет указать значения для списка генов, перезаписывающие значения, зарегистрированные в базе данных. Кроме того, полный список определяемых пользователем значений экспрессии генов может быть предоставлен с помощью кнопки Custom для условий, не представленных в используемых базах данных тканей.

Прогноз вредного воздействия мутации

Ожидается, что не все найденные варианты окажут предсказуемое влияние на передачу сигнала. Типы последствий (см. http://www.ensembl.org/info/genome/variation/predicted_data.html) описывают первичную классификацию возможных вариантов эффектов.Только подмножество типов последствий совместимо с вариациями, затрагивающими гены, кодирующие белок. К ним относятся: exon_variant, intron_variant, synonymous_codon, coding_sequence_variant, non_synonymous_codon, splice_region_variant, splice_acceptor_variant, splice_donor_variant, stop_gained, stop_lost, типы 5_prime_UTR_variant, 3_prime_UTR_variant, 5KB_upstream_variant, 5KB_downstream_variant .Consequence взяты из CellBase (19).

Как правило, стоп-лосс, стоп-гейн и варианты, нарушающие сплайсинг, считаются вредными мутациями.Воздействие и повреждающий эффект несинонимичных вариантов зависят от типа замены аминокислот и могут быть предсказаны путем вычисления показателей повреждения SIFT (20) и PolyPhen (21). За пределами кодирующих областей это предсказание может быть расширено с использованием показателя сохранения phastCons (22). По умолчанию считается, что варианты с оценкой сохранения phastCons выше 200, оценкой SIFT ниже 0,05 или оценкой PolyPhen выше 0,95 оказывают повреждающее действие на пораженный белок. Значения SIFT, PolyPhen и phastCons также берутся из CellBase (19) с помощью инструмента VARIANT (23) (см. аннотации версии базы данных на https://github.com/opencb/cellbase/wiki/Data-Sources-and-Species). Выбор по умолчанию: non_synonymous_codon, stop_gained и stop_lost типов последствий с пороговыми значениями SIFT и PolyPhen 0,05 и 0,95 соответственно, что соответствует более очевидному сценарию вредных вариантов с потерей функции.

Прогнозирование влияния вредной мутации на передачу сигналов

После того, как был смоделирован сигналом и получен невозмущенный сигнальный паттерн в любой ткани, предсказание эффекта вредных вариантов, влияющих на белки пути, становится простым.PATHiVAR удаляет из модели те белки, которые содержат вредные мутации (как определено пользователем), которые нарушают ее надлежащее функционирование, и пересчитывает вероятность передачи сигнала по всем цепям стимул-реакция путей, изучаемых в выбранной ткани, снова, получая, таким образом, нарушенная схема сигнализации .

Функциональность веб-интерфейса и управление данными

PATHiVAR можно напрямую использовать в анонимном режиме (пункт Run в главном меню), и поэтому все загруженные данные и полученные результаты (и не сохраненные в терминале пользователя) будут утеряны в конце сеанса. Программу также можно использовать в режиме «зарегистрированный пользователь». Регистрация бесплатна, и параметры те же, с той лишь разницей, что зарегистрированные пользователи могут хранить свои данные и результаты в рабочей области PATHiVAR с ограничением в 10 ГБ.

Запуск программы вызывает главную форму, в которую можно загрузить данные и предоставить параметры для анализа. Опция загрузки (опция Select VCF file ) формы вызывает рабочее пространство STUDIES , где находятся файлы данных VCF или куда их можно загрузить с локального компьютера.Если выбран файл с несколькими образцами VCF, конкретный образец для анализа можно выбрать с помощью параметра Имя образца из VCF (см. Рисунок 1A). Пути для анализа выбираются (рис. 1B). Анализируемая VCF снабжена аннотациями типа последствий, значений SIFT, PolyPhen и phastCons, взятых из CellBase (19) (см. рисунок 1C). Пользователь выбирает интересующую ткань (с возможностью изменения некоторых значений экспрессии генов, если это необходимо, через поле Дополнительный список генов ) или предоставляет полный список определенных пользователем экспрессий генов через кнопку Пользовательский , которые будут использоваться для модели, чтобы получить невозмущенную систему (рис. 1D).Затем можно указать тип наследования искомых мутаций (доминантный или рецессивный). Поддерживается сложная гетерозиготность (наличие одновременно двух разных рецессивных аллелей в определенном локусе). Последующие опции позволяют выбрать типы последствий, рассматриваемых в исследовании, и установить пороговые значения индексов патогенности. Эта информация будет использоваться для удаления генов, затронутых вредными мутациями, из модели и, таким образом, для получения возмущенной системы (рис. 1E и F).

Рисунок 1.

Схема анализа влияния мутаций на сигнальные пути. ( A ) Файлы VCF загружены в систему. ( B ) Выбраны определения пути KEGG. ( C ) Файлы VCF аннотируются с использованием информации, содержащейся в CellBase. Тип следствия, индексы SIFT, PolyPhen и phastCons связаны с каждой позицией варианта в VCF. ( D ) Выбирается ткань (или загружается определяемый пользователем образец присутствия/отсутствия генов) и невозмущенная карта передачи сигнала (соответствующая функциональным генам в ткани) выводится из присутствия/отсутствия генов в путь. ( E ) В зависимости от типа наследования (доминантная/рецессивная/компаундная гетерозигота) экспрессированные, но поврежденные белки удаляются из модели, и снова делается вывод о чистой передаче сигнала, что дает ( F ) нарушенную карту передачи сигнала. О различиях между невозмущенными (D) и возмущенными (F) картами передачи сигнала сообщает PathiVar. В правом нижнем углу рисунка показаны символы, используемые для обозначения экспрессируемых и неэкспрессируемых генов, генов, несущих вредные мутации, и взаимодействий, вызывающих передачу сигнала.

Рис. 1.

Схема анализа влияния мутаций на сигнальные пути. ( A ) Файлы VCF загружены в систему. ( B ) Выбраны определения пути KEGG. ( C ) Файлы VCF аннотируются с использованием информации, содержащейся в CellBase. Тип следствия, индексы SIFT, PolyPhen и phastCons связаны с каждой позицией варианта в VCF. ( D ) Выбирается ткань (или загружается определяемый пользователем образец присутствия/отсутствия генов) и невозмущенная карта передачи сигнала (соответствующая функциональным генам в ткани) выводится из присутствия/отсутствия генов в путь. ( E ) В зависимости от типа наследования (доминантная/рецессивная/компаундная гетерозигота) экспрессированные, но поврежденные белки удаляются из модели, и снова делается вывод о чистой передаче сигнала, что дает ( F ) нарушенную карту передачи сигнала. О различиях между невозмущенными (D) и возмущенными (F) картами передачи сигнала сообщает PathiVar. В правом нижнем углу рисунка показаны символы, используемые для обозначения экспрессируемых и неэкспрессируемых генов, генов, несущих вредные мутации, и взаимодействий, вызывающих передачу сигнала.

После того, как параметры анализа определены, заданию можно присвоить имя, а затем запустить алгоритм (кнопка Запустить задание ). После запуска задания оно появляется в списке заданий в рабочем состоянии. Когда задание завершено и результат доступен, задание отображается в статусе завершено с символом галочки.

Интерпретация результатов, вдохновленная системной биологией

Результирующий эффект комбинации экспрессии гена и целостности генного продукта при интерпретации в системе, определяемой топологией путей, может быть разнообразным и часто иметь неожиданные последствия. На рисунке 2 представлены различные сценарии, которые можно обнаружить при анализе сложных сигнальных цепей с точки зрения системной биологии, и они включают: (i) дезактивацию сигналов, когда поврежденные белки прерывают поток сигнала в рецепторно-эффекторной сигнальной цепи, в которую они включены; (ii) сигнальные активации, когда пораженный белок является репрессором, замыкающим цепь; (iii) нейтральные эффекты, когда сигнальная цепь рецептор-эффектор внутренне избыточна, и сигнал может достигать эффекторного белка, используя альтернативную незатронутую ветвь.Эта третья возможность весьма интересна, потому что изучение мутаций с точки зрения систем позволяет отбросить предполагаемые болезнетворные гены, содержащие мутации с очевидными вредными последствиями, которые из-за устойчивости пути превращаются в безвредные варианты; (iv) интеграция в модель данных как об экспрессии, так и о мутациях приводит к еще одной возможности, которая обычно игнорируется традиционными моделями без интеграции данных: вредные мутации, влияющие на гены, которые не экспрессируются в интересующей ткани, не имеют отношения к передаче сигналов в данной конкретной ткани. ткань.

Рисунок 2.

Результат вымышленной комбинации экспрессии генов и мутаций в версии кальциевого сигнального пути , модифицированного для иллюстрации примеров. На рисунке показаны возможные эффекты из-за комбинации экспрессии генов и потери функции генов в топологии пути. На рисунке синий фон указывает на экспрессию гена, а серый фон означает отсутствие экспрессии в исследуемой ткани. Желтый фон означает неизвестное выражение в ткани.Черная стрелка указывает на передачу сигнала, тогда как серая стрелка означает, что сигнал не передается. ( A ) деактивация сигнала: ген GNA11 экспрессируется, но содержит вредную мутацию, и сигнал не передается вниз по течению; ( B ) активация сигнала: репрессор INH содержит вредную мутацию и, следовательно, не может ингибировать PLN , и вместо этого активируется поток сигнала, который здесь был бы прерван функциональным белком; ( C ) нейтральный эффект: PLCG1 с вредной мутацией не передает сигнал, однако сигнал все равно передается от EGFR к обоим, ITPR1 и PRKCA , через белок PLCD3 , поскольку схема передачи сигналов рецептор-эффектор внутренне избыточна; ( D ) нейтральный эффект: несколько примеров показывают, как мутации влияют на гены, которые не экспрессируются в исследуемой ткани ( CACNA1A, CACNA1I, RYR1 и т. д.) и, следовательно, не оказывают влияния на конкретную изучаемую ткань.

Рисунок 2.

Вывод фиктивной комбинации экспрессии генов и мутаций в версии кальциевого сигнального пути , модифицированного для иллюстрации примеров. На рисунке показаны возможные эффекты из-за комбинации экспрессии генов и потери функции генов в топологии пути. На рисунке синий фон указывает на экспрессию гена, а серый фон означает отсутствие экспрессии в исследуемой ткани.Желтый фон означает неизвестное выражение в ткани. Черная стрелка указывает на передачу сигнала, тогда как серая стрелка означает, что сигнал не передается. ( A ) деактивация сигнала: ген GNA11 экспрессируется, но содержит вредную мутацию, и сигнал не передается вниз по течению; ( B ) активация сигнала: репрессор INH содержит вредную мутацию и, следовательно, не может ингибировать PLN , и вместо этого активируется поток сигнала, который здесь был бы прерван функциональным белком; ( C ) нейтральный эффект: PLCG1 с вредной мутацией не передает сигнал, однако сигнал все равно передается от EGFR к обоим, ITPR1 и PRKCA , через белок PLCD3 , поскольку схема передачи сигналов рецептор-эффектор внутренне избыточна; ( D ) нейтральный эффект: несколько примеров показывают, как мутации влияют на гены, которые не экспрессируются в исследуемой ткани ( CACNA1A, CACNA1I, RYR1 и т. д.) и, следовательно, не оказывают влияния на конкретную изучаемую ткань.

Графический вывод (рис. 2) представляет проанализированные пути, выделяя возможные способы передачи сигнала от рецепторных белков к соответствующим эффекторным белкам. Нарушения в потоке сигнала можно легко отнести к конкретным вредным мутациям, обнаруженным в файле VCF. Результаты отображаются в усовершенствованной интерактивной визуальной структуре CellMaps (https://github.com/opencb/cell-maps/wik), которая обеспечивает графический вывод, в котором можно легко определить внешний вид, цвета и формы компонентов пути. реконфигурирован для создания фигурок, готовых к съемке.В дополнение к графическому выводу каждый путь отображает таблицу, в которой перечислены затронутые цепи с соответствующей информацией, включая рецепторные и эффекторные белки, статус активации и конкретную клеточную функциональность, запускаемую цепью. Также можно скачать таблицу, обобщающую результаты, полученные для всех выбранных путей.

ОБСУЖДЕНИЕ

Традиционный анализ геномных данных направлен на то, чтобы связать экспрессию генов (24) или мутации (25) с болезнью или сложными фенотипами.Однако такие взаимосвязи трудно найти, и они часто не воспроизводимы (4,26). Считается, что интеграция обоих типов данных (27): активность генов (данные об экспрессии) и функциональность генов (поражены или не затронуты вредными мутациями) может быть полезной для определения приоритетов генов болезней. Однако интеграция данных сама по себе не охватывает сложную сеть молекулярных взаимодействий, которые определяют клеточную функциональность (28). С точки зрения системной биологии (29) заболевания можно интерпретировать как нарушение клеточных функций, представленных функциональными модулями, такими как проводящие пути (2).Следовательно, вполне вероятно, что у разных людей, страдающих одним и тем же заболеванием, не обнаруживаются общие мутации (или мутации в общих генах), а скорее затрагиваются общие функциональные возможности клеток. И это может происходить из-за того, что они представляют разные мутировавшие гены, влияющие на общую сигнальную цепь, которая запускает такую ​​функциональность (6,7). Здесь мы показываем, как простая булева модель, основанная на KEGG, одном из самых популярных описаний сигнальных путей (30), может напрямую интегрировать генную активность (экспрессию) и генную функциональность (мутацию).В будущем мы планируем включить различные описания сигнальных путей из других репозиториев, таких как REACTOME (31), а также позволить пользователям вводить свои собственные определения путей.

Перспектива системной биологии, обеспечиваемая моделями сигнальных цепей, представленными здесь, предлагает оптимальную структуру для обнаружения повторяющихся функциональных нарушений, которые могут быть лучше связаны с заболеваниями или сложными признаками, чем исходное необработанное геномное измерение (экспрессия гена или мутация), из которого были получены модели.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Министерство экономики и конкурентоспособности Испании [BIO2011-27069]; Conselleria d’Educacio Валенсийского сообщества [PROMETEOII/2014/025]; Fundació la Marató TV3 [151/C/2013]. Финансирование платы за открытый доступ: Министерство экономики и конкурентоспособности Испании [BIO2011-27069].

Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

1.

Секвенирование в генетике человека: дизайн и интерпретация

Нац.Преподобный Жене.

2013

14

460

470

2.

Модульная природа генетических заболеваний

клин. Жене.

2007

71

1

11

3.

Почему эпистаз важен для борьбы со сложными генетическими заболеваниями человека

Геном Мед.

2014

6

42

4.

и другие.

Повторяемость опубликованных анализов экспрессии генов микрочипов

Нац.Жене.

2009

41

149

155

5.

Сетевая медицина: сетевой подход к заболеваниям человека

Нац. Преподобный Жене.

2011

12

56

68

6.

Геномика и транскриптомика при открытии лекарств

Препарат Дисков. Сегодня

2014

19

126

132

7.

Системная диагностика: предвосхищение следующего поколения диагностических тестов, основанных на механистическом понимании болезни

Препарат Дисков.Сегодня

2014

19

108

112

8.

Вдоль сигнальных путей: подход эмпирического набора генов с использованием топологии путей

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

41

е19

9.

Больше возможностей благодаря графоструктурированным тестам дифференциальной экспрессии генных сетей

Энн. заявл. Стат.

2012

6

561

600

10.

и другие.

Подход, основанный на субпутях, для определения основной сети реагирования на наркотики

Биоинформатика

2011

27

649

654

11.

Оценка на основе путей при колоректальном раке с ранним началом предполагает фокальную адгезию и иммуносупрессию наряду с эпителиально-мезенхимальным переходом

PLoS Один

2012

7

е31685

12.

Определение функционального эффекта изменений экспрессии генов в сигнальных путях

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

41

W213

W217

13.

и другие.

Понимание механизмов заболевания с помощью моделей активности сигнальных путей

BMC Сист. биол.

2014

8

121

14.

и другие.

Тканевая карта протеома человека

Наука

2015

347

1260419

15.

и другие.

Обновление атласа экспрессии – база данных экспрессии генов и транскриптов по результатам экспериментов функциональной геномики на основе микрочипов и секвенирования

Рез. нуклеиновых кислот.

2014

42

Д926

Д932

16.

Интерактивная веб-платформа для помощи в определении приоритетов генов-кандидатов болезней в исследованиях секвенирования всего экзома

Рез. нуклеиновых кислот.

2014

42

В88

В93

17.

Данные, информация, знания и принципы: вернемся к метаболизму в KEGG

Рез. нуклеиновых кислот.

2014

42

Д199

Д205

18.

Идентификация ключевых процессов, лежащих в основе фенотипов рака, с использованием анализа биологических путей

PLoS Один

2007

2

е425

19.

CellBase, всеобъемлющий набор веб-сервисов RESTful для извлечения соответствующей биологической информации из разнородных источников

Рез. нуклеиновых кислот.

2012

40

В609

В614

20.

Прогнозирование влияния кодирования несинонимичных вариантов на функцию белка с использованием алгоритма SIFT

Нац. протокол

2009

4

1073

1081

21.

Несинонимичные SNP человека: сервер и опрос

Рез. нуклеиновых кислот.

2002

30

3894

3900

22.

и другие.

Эволюционно законсервированные элементы в геномах позвоночных, насекомых, червей и дрожжей

Рез. генома.

2005

15

1034

1050

23. ВАРИАНТ

: командная строка, веб-служба и веб-интерфейс для быстрой и точной функциональной характеристики вариантов, обнаруженных с помощью секвенирования следующего поколения

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2012

40

В54

В58

24.

Внедрение персонализированной медицины рака посредством анализа паттернов генной экспрессии

Природа

2008

452

564

570

25.

Секвенирование генома человека в норме и при патологии

год. преподобный мед.

2012

63

35

61

26.

Подводные камни при прогнозировании сложных признаков по SNP

Нац. Преподобный Жене.

2013

14

507

515

27.

Интеграция данных: проблемы при разработке лекарств

Нац. Преподобный Друг Дисков.

2005

4

45

58

28.

От молекулярной к модульной клеточной биологии

Природа

1999

402

С47

С52

29.

Системная биология: краткий обзор

Наука

2002

295

1662

1664

30.

Сравнение баз данных сигнальных путей клеток человека: эволюция, недостатки и проблемы

База данных

(Оксфорд).

2015

2015

1

25

31.

и другие.

База знаний пути Reactome

Рез. нуклеиновых кислот.

2014

42

Д472

Д477

© Автор(ы), 2015 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), что разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Почему и как дифференциальная сигнализация

Узнайте о важных характеристиках, преимуществах и применениях дифференциальной сигнализации, а также о надлежащих методах компоновки дифференциальных сигналов.

Основы: несимметричная и дифференциальная передача сигналов

Прежде чем перейти к дифференциальной передаче сигналов и их характеристикам, нам нужно изучить некоторые основы того, что такое несимметричная передача сигналов.

Односторонняя сигнализация

Односторонняя сигнализация — это простой и распространенный способ передачи электрического сигнала от отправителя к получателю. Электрический сигнал передается напряжением (часто переменным напряжением), которое относится к фиксированному потенциалу, обычно узлу 0 В, называемому «землей».

Один проводник несет сигнал, а другой проводник несет общий опорный потенциал. Ток, связанный с сигналом, проходит от отправителя к получателю и возвращается к источнику питания через заземление.Если передается несколько сигналов, в цепи потребуется один проводник для каждого сигнала плюс одно общее заземление; таким образом, например, по 17 проводникам можно передать 16 сигналов.

 

Несимметричная топология
Дифференциальная сигнализация

Дифференциальная сигнализация, менее распространенная, чем несимметричная, использует два дополнительных сигнала напряжения для передачи одного информационного сигнала. Итак, для одного информационного сигнала требуется пара проводников; один несет сигнал, а другой несет инвертированный сигнал.

 

Несимметричный и дифференциальный: общая временная диаграмма

 

Приемник извлекает информацию, определяя разность потенциалов между инвертированным и неинвертированным сигналами. Два сигнала напряжения «сбалансированы», что означает, что они имеют одинаковую амплитуду и противоположную полярность относительно синфазного напряжения. Обратные токи, связанные с этими напряжениями, также сбалансированы и, таким образом, компенсируют друг друга; по этой причине мы можем сказать, что дифференциальные сигналы имеют (в идеале) нулевой ток, протекающий через заземление.

При дифференциальной передаче сигналов отправитель и получатель не обязательно имеют общее заземление. Однако использование дифференциальной сигнализации не означает, что разность потенциалов земли между отправителем и получателем не влияет на работу схемы.

Если передаются несколько сигналов, для каждого сигнала требуется два проводника, и часто необходимо или, по крайней мере, целесообразно включать заземление, даже если все сигналы являются дифференциальными.Так, например, для передачи 16 сигналов потребуется 33 проводника (по сравнению с 17 для односторонней передачи). Это демонстрирует очевидный недостаток дифференциальной сигнализации.

 

Топология дифференциальной сигнализации

Преимущества дифференциальной сигнализации

Однако существуют важные преимущества дифференциальной сигнализации, которые могут более чем компенсировать увеличение количества проводников.

Нет обратного тока

Поскольку у нас (в идеале) нет обратного тока, эталон заземления становится менее важным.Потенциал земли может даже быть разным у отправителя и получателя или перемещаться в пределах определенного допустимого диапазона. Однако вам нужно быть осторожным, потому что дифференциальная передача сигналов со связью по постоянному току (например, USB, RS-485, CAN) обычно требует общего потенциала земли, чтобы гарантировать, что сигналы остаются в пределах максимального и минимального допустимого синфазного напряжения интерфейса.

Сопротивление входящим электромагнитным помехам и перекрестным помехам

Если электромагнитные помехи (электромагнитные помехи) или перекрестные помехи (т. е. электромагнитные помехи, создаваемые соседними сигналами) вводятся снаружи дифференциальных проводников, они добавляются в равной степени к инвертированному и неинвертированному сигналу.Приемник реагирует на разницу в напряжении между двумя сигналами, а не на несимметричное (т. е. относительно земли) напряжение, и, таким образом, схема приемника значительно снижает амплитуду помех или перекрестных помех.

Вот почему дифференциальные сигналы менее чувствительны к электромагнитным помехам, перекрестным помехам или любому другому шуму, который накладывается на оба сигнала дифференциальной пары.

Уменьшение исходящих электромагнитных помех и перекрестных помех

Быстрые переходы, такие как нарастающие и спадающие фронты цифровых сигналов, могут генерировать значительное количество электромагнитных помех.И несимметричные, и дифференциальные сигналы генерируют электромагнитные помехи, но два сигнала в дифференциальной паре будут создавать электромагнитные поля, которые (в идеале) равны по величине, но противоположны по полярности. Это, в сочетании с методами, обеспечивающими непосредственную близость между двумя проводниками (такими как использование кабеля с витой парой), гарантирует, что излучения от двух проводников будут в значительной степени компенсировать друг друга.

Работа при низком напряжении

Несимметричные сигналы должны поддерживать относительно высокое напряжение, чтобы обеспечить адекватное отношение сигнал/шум (SNR).Обычные несимметричные интерфейсные напряжения составляют 3,3 В и 5 В. Из-за их повышенной устойчивости к шуму дифференциальные сигналы могут использовать более низкие напряжения и при этом поддерживать адекватное отношение сигнал/шум. Кроме того, отношение сигнал-шум дифференциальной сигнализации автоматически увеличивается в два раза по сравнению с эквивалентной несимметричной реализацией, поскольку динамический диапазон дифференциального приемника в два раза превышает динамический диапазон каждого сигнала в дифференциальной паре.

Возможность успешной передачи данных при более низком напряжении сигнала имеет несколько важных преимуществ:

  • Можно использовать более низкие напряжения питания.
  • Меньшие переходы напряжения
    • уменьшить электромагнитные помехи,
    • снизить энергопотребление, а
    • допускают более высокие рабочие частоты.
Высокое или низкое состояние и точная синхронизация

Задумывались ли вы когда-нибудь, как именно мы определяем, находится ли сигнал в высоком или низком логическом состоянии? В несимметричных системах мы должны учитывать напряжение источника питания, пороговые характеристики схемы приемника, возможно, значение опорного напряжения.И, конечно же, существуют вариации и допуски, которые вносят дополнительную неопределенность в вопрос о высоком или низком уровне логики.

В дифференциальных сигналах определение логического состояния более простое. Если напряжение неинвертированного сигнала выше, чем напряжение инвертированного сигнала, у вас высокий логический уровень. Если неинвертированное напряжение ниже инвертированного, у вас низкий логический уровень. А переход между двумя состояниями — это точка, в которой пересекаются неинвертированный и инвертированный сигналы, т. е.д., точка пересечения.

Это одна из причин, по которой важно согласовать длины проводов или дорожек, несущих дифференциальные сигналы: для максимальной точности синхронизации вы хотите, чтобы точка пересечения точно соответствовала логическому переходу, но когда два проводника в паре не равной длины, разница в задержке распространения приведет к смещению точки пересечения.

Приложения

В настоящее время существует множество стандартов интерфейсов, использующих дифференциальные сигналы.К ним относятся следующие:

Ясно, что теоретические преимущества дифференциальной сигнализации были подтверждены практическим использованием в бесчисленных реальных приложениях.

Основные методы трассировки дифференциальных трасс на печатных платах

Наконец, давайте изучим основы трассировки дифференциальных трасс на печатных платах. Маршрутизация дифференциальных сигналов может быть немного сложной, но есть несколько основных правил, которые делают этот процесс более простым.

Соответствие длины и длины – соблюдайте равенство!

Дифференциальные сигналы (в идеале) равны по величине и противоположны по полярности.Таким образом, в идеальном случае через землю не будет протекать чистый обратный ток. Это отсутствие обратного тока — хорошая вещь, поэтому мы хотим, чтобы все было как можно лучше, а это значит, что нам нужны равные длины для двух дорожек в дифференциальной паре.

Чем больше время нарастания/спада вашего сигнала (не путать с частотой сигнала), тем больше вы должны обеспечить одинаковую длину трасс. Ваша программа компоновки может включать функцию, помогающую точно настроить длину трасс для дифференциальных пар.Если у вас возникли трудности с достижением одинаковой длины, вы можете использовать технику «меандр».

 

Пример извилистого следа
Ширина и интервал – не меняйтесь!

Чем ближе дифференциальные проводники, тем лучше будет связь сигналов. Генерируемые электромагнитные помехи будут компенсироваться более эффективно, а полученные электромагнитные помехи будут более равномерно связаны с обоими сигналами. Поэтому постарайтесь свести их очень близко друг к другу.

Проводники дифференциальной пары следует прокладывать как можно дальше от соседних сигналов, чтобы избежать помех.Ширина и расстояние между вашими дорожками должны выбираться в соответствии с целевым импедансом и должны оставаться постоянными по всей длине трасс. Поэтому, если это возможно, дорожки должны оставаться параллельными при движении по печатной плате.

Полное сопротивление – минимизируйте колебания!

Одна из самых важных вещей, которую необходимо сделать при проектировании печатной платы с дифференциальными сигналами, — это определить целевой импеданс для вашего приложения, а затем соответствующим образом расположить дифференциальные пары. Кроме того, следите за тем, чтобы колебания импеданса были как можно меньше.

Импеданс вашей дифференциальной линии зависит от таких факторов, как ширина дорожки, соединение дорожек, толщина меди, материал печатной платы и расположение слоев. Рассмотрите каждый из них, пытаясь избежать всего, что изменяет импеданс вашей дифференциальной пары.

Не направляйте высокоскоростные сигналы через зазор между медными областями на плоском слое, так как это также влияет на ваш импеданс. Старайтесь избегать разрывов в наземных плоскостях.

Рекомендации по компоновке — прочитайте, проанализируйте и обдумайте их!

И, наконец, что не менее важно, есть одна очень важная вещь, которую вы должны сделать при разводке дифференциальных дорожек: получить техническое описание и/или примечания по применению для микросхемы, которая отправляет или получает дифференциальный сигнал, прочтите рекомендации по компоновке, и внимательно их анализировать.Таким образом, вы можете реализовать наилучший макет в рамках ограничений конкретного дизайна.

Заключение

Дифференциальная передача сигналов позволяет нам передавать информацию с более низкими напряжениями, хорошим SNR, улучшенной устойчивостью к шуму и более высокими скоростями передачи данных. С другой стороны, количество проводников увеличивается, и системе потребуются специализированные передатчики и приемники вместо стандартных цифровых ИС.

В настоящее время дифференциальные сигналы являются частью многих стандартов, включая LVDS, USB, CAN, RS-485 и Ethernet, поэтому все мы должны быть (как минимум) знакомы с этой технологией.Если вы на самом деле проектируете печатную плату с дифференциальными сигналами, не забудьте свериться с соответствующими таблицами данных и примечаниями к приложениям и, если необходимо, прочитайте эту статью еще раз!

 

Рекомендуемое изображение предоставлено Hardwareonkel (собственная работа) [CC BY-SA 3.

Author:

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.